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如何养出一盘饱满漂亮的细胞

2019-09-23 12:02 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂

     临近开学,我司技术支持(兼心理辅导师)经常收到这样焦虑的问题:“ 老si,你好,如何才能收获一盘漂亮的细胞呢?为啥别人家的细胞养得那么好呢,我的就一言难尽呢”养出漂亮细胞 这个事儿本就说来话长~之前讲过细胞贴壁、老化、成团、冻存、复苏、污染等问题 。这次小编又整理了一遍,先看看这些基本点是否都做好了

 

绝对的无菌意识
1. 细胞刚拿到手最好先做一下支原体检测,发现有污染迅速处理掉。
2. 严格无菌操作,BI也提供Pharmacidal喷壶,有效预防真菌(和孢子),细菌(和孢子),支原体和病毒 (包括HIV和Hepatitis B) 的生长和污染。
3. 真的不要和别人共用试剂耗材,自己准备一套!
4. 水浴锅很脏,可用BI Aquaguard-1 消毒水盘,效果非常好。
5. 最好是同一时间只有一个人在细胞房养细胞。

用好培养基和血清
1. 养细胞之前,就要先了解细胞的来源、种类、名称,查阅一定量的文献,确定所需培养基种类及是否需要添加特殊成分。
2. 血清主要功能是补充细胞生长因子,提供细胞生长所需的蛋白质、脂肪、糖类、不同细胞对生长因子的要求也不一样。血清替代物取代血清补充生长因子和蛋白质,但不一定是最适合细胞的,因此使用时要注意,避免引起细胞分化或老化。
3. 这里我们顺便说一下常见的血清沉淀:血清沉淀是血清纤维的凝集,不影响细胞生长,不必惊慌!我们建议2000rpm离心5min取上清即可,并不影响血清质量。
4. 如果细胞活力差,可增加血清浓度到20%, 给细胞较多的生长因子,等细胞长起来再降回原来的浓度。
 

了解细胞生长习性 
不同的细胞生长习性不同,了解细胞生长习性,正确计数,才能掌握好传代密度。对于一般细胞株,控制在三天一传,是比较合适的,细胞不会太挤也不会太寂寞。但例如癌细胞,一发起疯来半天就可以传代,不及时换液或扩增分分钟会饿死或挤死。
所以刚开始接触一款细胞,要勤观察,及时掌握它的生长情况。掌握细胞的生长节奏之后可以变成一天一看或两天三看,毕竟太频繁的把它从培养箱里拿出来也不太好。
 

胰酶消化程度是要害
消化一定程度上是对细胞的一种折磨,在使用胰酶(Trypsins)细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长,否则细胞铺板后生长状况会较差,做流式时的CD Marker 也可能会下降。

对大部分细胞消化来说,可以在消化到差不多快要脱落的时候,移除大部分胰酶,然后直接加新鲜的培养基将细胞吹打下来,省去离心步骤。残余的胰酶含量很低,所以不会对细胞产生任何影响。
对于难消化的细胞,如HCT15, LS411和KM12,用不含Ca2+、Mg2+的PBS洗涤一次后,加入稍微多一点胰酶,置37ºC彻底消化(一般为几分钟)至脱落(一晃细胞就掉下来),然后再加含血清的培养基终止胰酶反应、离心 (若是无血清培养基,需改加胰酶抑制剂)。这么做的道理是,细胞消化不彻底,势必会增加吹打辅助脱落的次数,而吹打次数越多,细胞活性越差。
 

培养瓶的选择
一般,生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态,那么采用塑料瓶会比玻璃瓶的效果好;生长速度快的细胞,用玻璃瓶培养的效果会更好。因此,对于同一种细胞,在其生长速度慢的时候(比如细胞刚复苏时或者原代培养),塑料瓶会好一点;而在其生长旺盛的时候,玻璃瓶则相对会好一点。
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