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无蛋白封闭液——WB实验成功的重要一步

2019-09-23 11:58 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂
一提到WB封闭液,人们最先想到的就是脱脂奶粉和BSA,其封闭原理就是利用封闭液中的蛋白成分以吸附的方式结合于膜表面的空白间隙,从而避免一抗的非特异性结合。事实上,除了常规蛋白质配方的封闭液之外,无蛋白-纯化学配方的封闭液(BlockPRO TM  protein-free Blocking Buffer)也具有很强大的应用前景
作用原理
主要成分为碳氢化合物,包含-CHn、-C6H5,碳氢基团以疏水性作用力结合PVDF膜或NC膜。
与常规蛋白配方封闭液相比具有以下优点:
  1. 无蛋白配方,杜绝封闭液与蛋白样品之间的相互作用
  2. 封闭更有效:小分子结构小,空间位阻小,有利于充分封闭目标蛋白周围膜空间,又不遮盖目标蛋白区域
  3. 高信噪比:提供比传统封闭缓冲液更好的特定信号和更少的背景噪声
实验数据
  1. 小分子封闭更有效,提升灵敏度,降低背景噪声
Sample: THP-1 cell lysates ; Blocking time: 1 hour ;Target antigen: pAMPK ; Exposure time: 30 sec
相较于脱脂奶粉、BSA、Casein等蛋白质配方封闭缓冲液,BlockPRO封闭缓冲液具有更好的信号强度
      b. 无蛋白配方,不易滋生霉菌,延长抗体使用次数BlockPRO封闭缓冲液为纯化学配方,不含蛋白质,稀释抗体可延长保存时间,抗体重复使用次数增加
应用无蛋白封闭液,以下问题迎刃而解
问题1:使用脱脂奶粉作为磷蛋白检测的封闭液,为什么检测不到条带??
问题分析及解决办法:磷蛋白信号本来就不强,脱脂奶粉中含有磷蛋白,产生了更多的非特异性信号;无蛋白封闭液为纯化学配方,杜绝封闭液与蛋白样品之间的相互作用,使用更有效
 
问题2:使用BSA作为封闭液,为什么有的时候会出现背景太高,特异性信号弱的现象?
问题分析及解决方案BSA蛋白分子量很大,由于空间位阻可能在目的蛋白邻近空隙进行过度填充,遮盖部分目的蛋白信号;无蛋白封闭液主要成分为化学合成的小分子,空间位阻小,有利于充分封闭目标蛋白周围膜空间,又不遮盖目标蛋白区域
 
问题3:用BSA或脱脂奶粉稀释的抗体,放冰箱,第二次使用的时候发现臭了
问题分析及解决方案:封闭液中含有的蛋白容易滋生霉菌,即使放冰箱也不能长时间保存抗体;无蛋白封闭液中不含易滋生霉菌成分,可延长抗体保存时间
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