单细胞蛋白质组学：从小样本中获得大见解

以往，大量细胞分析提供了蛋白质、基因或代谢物的平均值。如今，单细胞分析正在揭示组织内各个细胞之间的差异。这些信息将有助于人们从细胞和分子层面上了解因果关系，也有助于解释复杂的疾病状态是如何产生并持续存在的。

大量细胞分析无法了解不同的细胞类型及其功能，它只能提供一个读数，代表细胞的平均反应。这种平均值，不仅包括感兴趣的特征（比如细胞表面标志物或其他表型），还包括实验假象和错误，因此混淆了特定细胞对这些事件的贡献。

对蛋白质组学而言，单细胞分析的局限性在于样本太小（单个细胞）以及它们所含的蛋白质数量极少。“获取细胞不是问题，“问题在于，为了达到统计能力，您必须分析数百个或数千个细胞。每次LC/MC分析大约需要一小时，那么一项简单的研究可能就需要十天左右，前提是一切都按计划进行。”

此外，人类细胞会产生8万到40万种不同的蛋白质。并非所有蛋白都同时表达，有些是某个基本分子的不同亚型（isoform）。“大海捞针”的比喻也许是恰当的。单细胞蛋白质组学方法每天最多能分析300个细胞，对每个细胞中的2500个蛋白进行定量分析。
单细胞工作流程

单细胞流程当然也是从样本处理开始。对样本进行处理，使细胞分开和悬浮，然后通过荧光活化细胞分选（FACS）进行分离。单个细胞被分配到微量滴定板的各个孔中或芯片型分析系统上，在那里进行裂解。干扰质谱分析的裂解剂需要除去，但由于纯化会导致样本损失，因此研究人员尽量避免使用。

FACS是细胞分选的shou选方法，但也存在缺点。损失率高（有时非常高），需要训练有素的操作人员，而且购买和操作成本都很高。

当然，损失并不仅仅发生在细胞分选阶段。“粘稠的蛋白质很难通过液相色谱（LC）分离，因此这个步骤也会造成损失。这将会进一步造成灵敏度问题或分析偏倚。有时，您只是无法从单个细胞的蛋白质中产生足够的离子。”

为了解决这些灵敏度问题，一些操作方案将未标记的载体蛋白添加到混合物中，以缓解小样本量带来的损失。虽然这些方法有点用，但仍需要质谱技术的进步，特别是在电离效率方面的进步，才能处理小的样本量和体积。

“如果没有自动化液体处理系统，这些工作流程将无法实现，自动化系统带来了准确的纳升级流体操作，以及一致性和稳定性。”

早期对单细胞蛋白质组学的尝试使用了基质辅助激光解吸电离（MALDI），这是一种软电离技术，可以保留不稳定的分子特征，并最大限度减少样本损失和样本制备步骤。

基于MALDI的方法是在上世纪90年代首次使用的。人们采用MALDI作为离子源，并用飞行时间（TOF）作为质量分析器，从而提供一种功能性的单细胞分析。不过，这些技术存在三个主要缺点：MALDI不能在时域内分离肽段，无法对大量蛋白质进行测序，而且MALDI电离的可变性会影响定量的准确性。

另一种电离蛋白质的方法，电喷雾电离（ESI），则更容易实现测序，因为它很容易与各种分离方法（如毛细管电泳）相结合。然而，ESI需要大量的样本制备，这可能导致损失，让人们无法接受。

应对未来的挑战

单细胞蛋白质组学也许更适合勇敢的人。这项技术还需要很多工作，才能满足成本、灵敏度、稳定性和可靠性等方面的需求，应用于日常科研、生物制造和诊断。

“不过在此之前，人们必须解决单细胞分离的挑战，以及验证质谱技术和流程的挑战。此外，临床背景下的技术人员还需要更多的全面整合流程。目前运行16个样本大约需要两到三个小时，这也需要改进。”