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纤维素酶活性测定的方法

2019-09-27 15:07 来源:上海远慕生物试剂

纤维素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称,它不是单体酶,而是起协同作用的多组分酶系,是一种复合酶,作用于纤维素以及从纤维素衍生出来的产物。

纤维素酶的组成与功能

纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡萄糖酶(1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.4),来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡萄糖酶(1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase,EC.3.2.1.91),来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶(β-1,4- glucosidase,EC.3.2.1.21)简称BG。内切葡萄糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端,释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大,在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶。

纤维素酶活性测定(3,5-二硝基水杨酸法)

实验原理:纤维素酶水解纤维素,产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖,能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物,利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。

实验试剂:

1. 3,5-二硝基水杨酸显色液:称取10g 3,5-二硝基水杨酸,溶入蒸馏水中,加入20g分析纯氢氧化钠,200g酒石酸钾钠,加水500ml,升温溶解后,加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌,待全溶后冷却,定容至1000ml。存于棕色瓶中,放置一周后使用。

2. 0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液,溶解后成胶状液,静置过夜。使用前摇匀。

4.标准葡萄糖溶液:称取干燥至恒重的葡萄糖100mg,溶解后定容至100ml,此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。

5.酶液:将0.05g酶溶解定容至50ml,从中取出1ml再定容至100ml,待测。(用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制)

实验器材:

1. 比色管10支。

2. 722型分光光度计。

3. 滴管。

4. 水浴锅。

5. 移液枪。

6. 电炉。

实验步骤:

1. 标准曲线的绘制:分别吸取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ml的葡萄糖于5支比色管中,均用蒸馏水稀释至1ml,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3ml,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21ml,摇匀。以1ml蒸馏水代替糖作空白管,在550nm处比色。以光密度为纵坐标,以葡萄糖微g数为横坐标,绘出标准曲线。

2. 空白管的测定:取1ml酶液,沸水浴5分钟,冷却加3ml0.5%CMC,与样品管同时放入50度水浴30分钟。其它操作同样品管。

3. 样品的测定:取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml,酶液1ml,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液,冷却加入3ml显色液,再沸水浴10分钟,冷却后加水定容至25ml,混匀,550nm测OD值。

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