消化传代影响细胞培养的形态吗?

  很多同学都遇到过这个问题，自己养的细胞开始的几代长的还挺好的，可是穿过几代之后就发现自己的细胞不行了，状态越来越差劲了。对于这个问题，可以非常肯定地说，你的消化环节出问题了。你每一次的消化都让细胞受到较大损伤了。所以，越长越差。

  在消化的过程中，你加入胰酶后，所有细胞都在被胰酶消化着，但是我们忽视了一个问题就是，细胞的生长状态是不一样的，每一个细胞的贴壁情况也是不一样的，有的贴壁牢固，有的贴壁没有那么牢固的，所以，让所有的细胞消化同样的时间对细胞是不公平的，他们受到了差别待遇当然会有脾气啊。我后来对消化的方法进行了改良，我称之为四步消化法，以难消化细胞为例，具体操作如下：

1. 首先不加胰酶，倒掉旧培养基加入少量新培养基洗 1-2 遍。这是前奏，即为第一步，目的是将漂浮着的死细胞之类尽量洗掉。

2. 然后再加入少量新培养基直接吹打一遍，这一遍是把贴壁不牢固的细胞吹打下来。再用培养基洗一遍，两次所得悬液混合传入新瓶，即为第二步。你可以将这些传入新瓶培养，以与后面胰酶消化过的细胞对比观察看谁长的更好一点就知道该细胞对胰酶的敏感度了。

3. 吸干净瓶内剩余液体，加入 0.3 mL 左右的胰酶润洗一遍，吸掉弃之，再加入 1 mL 左右的胰酶消化。消化的同时置于显微镜下观察，待细胞与细胞之间间隙明显的时候立即吸掉胰酶与干净子弹头里备用，加入新培养基开始吹打，吹打 2-3 遍后吸取悬液于试管或新瓶暂存。用 2 mL 左右新培养基洗一遍与前面的混合。你也可以传入新瓶培养，以与后面及前面的做对比。这是第三步。

4. 然后把前面刚吸出来的胰酶重新加进去瓶里继续消化剩余的贴壁牢固的细胞。当然你也可以用新的胰酶，如果你们那比较富裕的话。继续镜下观察，待剩余细胞间隙明显，细胞独立开来的时候，吸掉胰酶，加入新培养基吹打。悬液传入新瓶培养，根据实际情况你自己把握。这是第四步。

  其实还可以有第五步，对于特别难消化的细胞和对胰酶特别敏感的细胞的话，你可以继续加第五步甚至第六步。为了细胞更好的状态，更漂亮的样子，没办法，你必须分多批多次消化，这样才能最大限度地将胰酶对细胞的损伤降到最低，保证细胞的状态能够最优。

  当然了，如果细胞是属于那种很容易消化的细胞，像 RAW264.7，仅仅第二步就搞定了。就没必要第三步第四步了。这个是需要你在实验中能够自己用心去体会的。建议你接手一个新细胞时把各步消化的细胞分别培养起来做比较，去摸索好细胞对胰酶的要求，便于你后续实验的开展。

  将细胞消化分成这几步，除了是为了避免胰酶对细胞的损伤之外，还有一个更重要的作用就是，可以最大程度地把细胞吹打成单个单个的状态，不成片不连体。

  因为细胞生长的时候肯定是要相互联系，大部分的细胞都是要成片生长的，尤其是对于贴壁细胞，单个细胞贴壁之后长着长着就长到一片去了。但是如果是成片的细胞抱团的话，传代后细胞是不能贴壁的，这样抱团的细胞就会死亡。所以，消化传代的时候一定要将细胞消化成单个单个的独立状态，这个是非常考究你的功夫的。

   细胞一旦脱落入悬液里你很难再将他吹打成单个，因为他没有受力点了。很难找到受力点让你对他吹打的力分散开细胞。所以必须要在细胞未脱落之前将其吹打开，受力点就是细胞贴壁的地方。这样你就必须要严格控制好消化的程度，这和大师做饭掌握好火候是一样的道理。

   既要消化到容易吹打下来，又不能太过，一吹就整片脱落，要单个单个地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是为了保证不同生长状态贴壁程度的细胞能够都维持在好的受力点分散开。这个是很重要的一点。尤其是对于某些细胞这一点就是他活或死的致命点，像 Caco-2 细胞就是如此。

  另外关于传代很重要一点就是一定不能等到细胞长满的时候才去消化传代。要在细胞长到 70% 左右的时候就要传代了，一旦发现细胞生长中已经有叠层生长的时候就要立即进行消化传代，不能再拖。