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如何测量RNA浓度、如何检测RNA的完整性?

2018-11-20 16:59 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂

一般通过总量,纯度与完整性三大项检测来确认RNA质量:
1总量:微量分光光度计测260nm吸收值计算。
2纯度:微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值,用于评估有机溶剂残留;260nm/280nm吸收值的比值,用于评估蛋白质污染比例。
3完整性:以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis),并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估,10为RNA完整性最好,0为最差。

RNA质检参数中260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。其中:

A230: 测定其它碳源物质,如酚,糖类等。
A260:核酸的吸收峰测,测RNA,DNA,引物等的浓度用的。
A280:蛋白质的吸收峰。
一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)在1.8~2.1范围内时,我们认为 RNA中蛋白的污染是可以容忍的,不过要注意,当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时,R 值可能会大于 2(一般应该是<2.2的)。当R 1.8时,溶液中蛋白的污染比较明显,可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当R > 2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了,而纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。

 

检测RNA的完整性的方法:

  1. 完整的总RNA在进行变性凝胶电泳时会产生清晰的28S和18S rRNA条带(真核样品)。28S rRNA条带的强度应当大致为18S rRNA条带的两倍。这种2:1的比率(28S:18S)是判断RNA完整性的一个很好的指标。

  2. 使用变性凝胶电泳来评估RNA完整性的一个缺陷是观察所需的RNA样品量。通常情况下,需要在变性凝胶中上样至少200 ng的RNA才能在EtBr染色下进行观察。而在某些RNA制备实验中,如从穿刺活检样品或激光捕获显微切割样品中提取RNA,得率是非常低的。这种情况下,或许就不可能在进行表达谱分析实验前取出200ng的RNA来评估其完整性。其它的核酸染料,比如Moleculor Probes (Eugene, OR) 的SYBR&#174; Gold及SYBR Green II RNA染料,相比传统的琼脂糖凝胶电泳EtBr染色方法可以显著提高灵敏度。通过使用300nm的透射光源(6 x 15瓦的灯泡)及特殊的滤光片,SYBR Gold RNA凝胶染色可以检测到低至1ng的RNA,而SYBR Green II则可以检测到2ng,从而可以使用更少的样品来进行RNA完整性分析。

  3. 目前有一种快速简单的方法可以替代传统的凝胶分析方法,这种方法可以同时对RNA样品进行定量及质量评估。Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)是第一款商业化的提供RNA样品状态细节信息的微流体仪器。当与RNA 6000 LabChip&#174;(Caliper Technologies Corporation所拥有的一个注册商标)结合使用时,每次进行分析最低仅需1&#181;l浓度为10 ng/&#181;l 的样品。除了评估RNA完整性,这台自动化系统同样可以提供样品RNA浓度及纯度(如mRNA制备中的rRNA污染)的评估。在过去,检测浓度及纯度需要使用部分RNA样品(通过A260分光光度法),而评估完整性则需要另外使用部分样品。通过使用LabChip&#174;系统,可以仅使用一份5ng的样品来同时对浓度、完整性及纯度进行分析。分析数据可以显示为类凝胶图像、电泳峰图及表格形式等。

 

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