荧光定量PCR标准曲线有几个梯度?

相对定量

相对定量得到的结果为特定样本中目的基因相对于另一参照样本的量的变化。

在某些不需要对基因进行绝对定量，只需要确定基因相对表达差异的情况下，如某样品在经过某种处理后目的基因表达量是增加了还是减少了，用相对定量的方法就可以得到结果，相对定量是一种更普遍、更简单的方法。

内参基因

实验操作中，由于选取样品时，其细胞个数不可能完全相同、RNA提取的得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中需要使用内参基因来标准化样品，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。

相对定量就是通过检测目的基因相对于内参基因的表达变化来实现定量的。

内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作内参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因、18S rRNA基因等。

内参基因需满足：

在研究样本之间的表达是相似的；

处理因素不会影响其表达；

与待测基因同时进行相同的PCR扩增。

尽管在大多数情况下内参基因的表达非常稳定，但是其表达在某些情况下也会发生变化，并不是任何内参基因都适合任何实验。在选择内参基因时，应仔细考虑各种因素，选择合适的内参基因或内参基因组合。

基因表达变化倍数计算方法

比较Ct法是运用数学公式来计算基因表达的相对变化量，用该方法进行基因表达定量时，来自于同一样品的目的基因和内参基因都要进行Real-Time qPCR反应，定量的结果由目的基因与内参基因Ct之间的差值来反应。

该方法除了使用内参基因以外，还使用了参照样品，使得能够比较机体的不同组织或不同实验处理组之间的基因表达变化。

使用该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，但是内参基因毕竟与目的基因存在较大的异源性，所以在反应过程中会出现扩增效率不一致的问题。

在Real-time qPCR实验开始之前必须分别对目的基因和内参基因绘制标准曲线，比较两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。

扩增效率测定

相对定量的标准曲线绘制方法与绝对定量基本相似，不同之处是绝对定量中只用构建目的基因的标准曲线，而且用于构建标准曲线的标准品的量是预先已知的，而相对定量中需要同时构建目的基因和内参基因两条标准曲线，并且相对定量中所用的标准品不需已知其准确的拷贝数或浓度。

该方法的第一步是制备标准品，通常选择提取得到的浓度较高的待测样品RNA即可，将其反转为cDNA后，进行连续的5倍或10倍梯度稀释，得到5～6个用于绘制标准曲线的梯度稀释样品。

第二步就是分别用梯度稀释标准品绘制目的基因和内参基因的标准曲线，然后根据标准曲线计算目的基因和内参基因的扩增效率。

参照样品的选择

根据不同的实验类型，具有以下3种情况：

某处理方法对基因表达的影响，将未处理的样本作为参照样本；

检测基因在不同时间的表达差异，将0时刻的样本作为参照样本；

比较基因在不同组织中的表达差异，人为选定一个组织作为参照样本。