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遇到酶切不动或切不完全的处理办法

2023-03-22 11:19 来源:上海远慕生物试剂
遇到这种问题常常需要了解酶活性单位是如何确定,我们多次接到这样的问题:1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切完全? 从下面几个因素去考虑:
1) 酶是否有活性:酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板,也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的,虽然识别位点相同,但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式,通常需要用lambda DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感,还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降,这种情况是很少发生。远慕销售的酶,在分装前严格检验过,不合格的东西(很少)都退回原厂,所以不合格的产品是不会送到用户手头的。

2) 模板性质是否清楚:如果 DNA的类型变了所需要的酶量也不同。酶切效果与DNA的性质(线状,超螺旋状)、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状DNA完全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍(在我们的目录上有部分酶是有标注的),同时需要提高酶的用量(10U/ug)和延长反应时间等措施。还有一个问题是有些时候DNA是从别人那里得到的,背景不清楚也造成困惑。

3) 模板纯度是否够:模板制备方式影响DNA的质量,制备过程中使用到乙醇,氯仿,苯酚,SDS, EDTA等如果残留在最终的DNA模板中,都会不同程度影响酶的活性。Miniprep时如果用试剂盒抽提,需要的问题污染是变性剂和乙醇;如果是手工制备的,氯仿,乙醇,苯酚及细胞内其他杂质都会不同程度的干扰酶活性。

4) 甲基化程度对酶的活性是否有影响:细菌中主要有Dcm和Dam两种甲基化方式,在植物和动物细胞中主要是CG位被甲基化。仔细看看使用的酶对甲基化的敏感情况,或许能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。

5) 反应条件是否合适:对照说明书,检查使用的温度是否正确,是否需要添加BSA, 是否使用正确的缓冲溶液。由于缓冲液中基本都含有DTT,反复冻融会使模板使DTT降解。注意有些研究人员将buffer长时间放在4度或室温,这是很不规范的行为。

6) 酶稀释和添加方式是否正确:一般要求在最后加酶,但是对同时做多个相同反应的时候,最后加酶有可能不很方便。通常是将缓冲、酶和适量的水配制成一个混合物,然后分装,最后加模板。需要提醒的是混合物(Master Mix)中由于没有底物的存在,离子强度也不对,酶可能要受到损伤。这种提前混合的做法没有问题,只是动作要快一些,没有分装前的Mix,要求放在冰里,尽快使用。
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