核糖核酸酶A(RNase A)的主要用途介绍

核糖核酸酶A（RNase A）来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端，切割胞嘧啶或尿嘧啶与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，反应终产物是3’嘧啶核苷酸和末端带3’嘧啶核苷酸的寡核苷酸。无辅助因子及二价阳离子存在时，核糖核酸酶A的作用可以被胎盘RNA酶抑制剂（RNasin）或氧钒一核糖核苷复合物（vanadyl—ribonuclosidecomplex，VRC）所抑制。RNase A的反应条件极广，且极难失活。在低盐浓度（0～100 mmol/l NaCl）下，RNase A切割单链和双链RNA、DNA：RNA杂交体中的RNA；当NaCl浓度为300 mmol/l。或更高时，RNase A就特异性切割单链RNA。去除反应液中的RNase A，通常需要蛋白酶K处理、酚反复抽提和乙醇沉淀。 在分子克隆中，核糖核酸酶A的主要用途为：

①从DNA：RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。

②确定RNA或DNA中的单碱基突变的位置。在RNA：DNA或RNA：RNA杂交体中，若存在单碱基错配，可用RNAse A识别并切割。通过凝胶电泳分析切割产物的大小，即可确定错配的位嚣。

③RNA检测。RNA酶保护分析法（RNase protection assay）是近年来发展起来的一种检测RNA的杂交技术。其基本原理是利用单链RNA探针，与待测的RNA样品进行杂交形成RNA：RNA双链分子，由于RNA酶可专一性地降解未杂交的单链RNA，而双链受到保护不被降解，经凝胶电泳可以确定目的RNA的长度。该方法灵敏度较Northern杂交法更高，并可进行较为准确的定量。选择适当的探针，还可进行基因转录起始位点分析及内含子（也称内元）剪切位点分析等研究。此法的灵敏度比核酸酶S1保护分析法高数倍。

④降解DNA制备物中的RNA分子。须使用无DNAsd的RNase（DNase I free RNase），市售的一般RNase A常含有DNase，可在100 retool/I Tris—CI（pH 7．5）和15 mmol/l。NaCI溶液中100℃加热15 min，以去除之。