对DNA分子做酶切时的注意事项

如果是要做酶切，提质粒的最后一步最好是用水溶解DNA，因为TE里面的离子会影响酶切的效率。

双酶切制备克隆插入片段的载体，最好选择带有外源片段的质粒，是否酶切完全，从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切完全和双切完全在分子量上差异不大。

在做酶切时，也可以象PCR一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分装，然后再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：

（1）各反应成分均一；

（2）可大大减少限制型内切酶的使用；

（3）节省时间。 连接酶的常见种类和作用机制

1、T4DNA连接酶

T4DNA连接酶是目前应用比较多的病毒基因组编码的DNA连接酶，在基因重组中广泛使用。噬菌体类型较多，目前研究发现T4噬菌体能够合成T4DNA连接酶，并且已经能够从被T4嗜菌体感染的大肠杆菌中提取该酶，此外科学家也已经定位该酶的合成基因，即噬菌体T4的30基因。T4DNA连接酶具有连接黏性末端和平末端的作用，研究人员总结DNA片段的连接过程，认为整个DNA连接反应可以通过三个连续步骤来完成：

（1）ATP通过断裂最后一个高能磷酸键释放能量，同时产生的AMP和T4DNA连接酶利用ATP水解释放的能量形成E-AMP复合物；

（2）所形成的E-AMP复合物可以识别DNA双链之前被切开的切口，识别之后AMP会脱离E-AMP复合物并与DNA的5’-P基团结合；

（3）需要连接的另外一段DNA分子片段的3’-OH会攻击第二步形成5’-P-AMP，3’-OH和磷酸基团残基发生反应形成磷酸二酯键，同时释放出一个AMP。

2、 真核生物DNA连接酶

真核生物存在3种ATP依赖型DNA连接酶——DNA连接酶Ⅰ、DNA连接酶Ⅲ和DNA连接酶Ⅳ。研究显示，DNA连接酶Ⅰ和DNA连接酶Ⅳ广泛分布于真核生物中，如植物界和动物界，DNA连接酶Ⅲ则主要分布于脊椎动物中。

目前科学家认为，在真核生物DNA复制过程中，起到连接作用的可能主要是DNA连接酶Ⅰ，DNA连接酶Ⅰ活性的调节与其氨基端有关，在其氨基端靠近活性中心有一个特定的部位，该部位可以通过磷酸化作用来调节DNA连接酶Ⅰ的活性。DNA连接酶Ⅰ的作用就是将DNA复制时复制叉处形成的不连续的后随链（冈崎片段）连接起来。在此过程中DNA连接酶Ⅰ并不是单独起作用，而是需要和多种蛋白因子密切合作共同完成。在真核生物DNA复制时，后随链是由DNA聚合酶α催化合成的，DNA聚合酶α先催化合成一段引物，然后依赖DNA聚合酶δ与增殖细胞核抗原（持续复制因子），从引物开始合成DNA，然后引物通过降解出去。此外，在损伤的DNA的碱基修复中，DNA连接酶Ⅰ也同样起到重要的作用。首先细胞内的特异性的核酸内切酶和外切酶特异性识别损伤部位，在DNA单链损伤部位的附近进行剪切，切除一段DNA，然后DNA聚合酶以另一条完整的DNA链作为模版进行修复合成重新合成这段DNA，最后由DNA连接酶Ⅰ将缺口连接。