琼脂糖凝胶电泳技术要注意的小细节

琼脂糖凝胶电泳是利用DNA、RNA分子带负电荷磷酸基团的特性，通过电流使得片段大小不同的核酸由负极的凝胶孔中缓慢向正极移动，最终达到分离核酸分子的技术。由于分子量小的核酸片段在凝胶中移动速度较快，分子量大的核酸片段移动相对较慢的特点，就可以将分子量不同的核酸片段区分开，再结合DNA Marker，即DNA分子量固定已知的标准品进行分析，就可以准确识别和判断核酸片段大小，也就是跑出来的“小东西”到底是不是我们想要的目的基因。 琼脂糖凝胶电泳技术目前在生物学科中有非常广泛的应用，但是在这个过程中有几点小细节还需要我们多多注意哦：

①琼脂糖凝胶制备。在制备之前，我们首先要确定琼脂糖凝胶浓度，当我们需要跑小片段核酸时，就需要制备浓度较高的琼脂糖凝胶，这样DNA片段跑起来的阻力变大，速度变慢，反之亦然。通常情况下，琼脂糖凝胶的浓度在1%左右，即1克琼脂糖与100毫升电泳缓冲液混匀制成，二者体积总和不要超过锥形瓶的三分之一。摇晃混匀后用微波炉加热到微沸状态，摇匀后继续加热至微沸状态，再次摇匀，反复多次，直至溶液变的清澈明亮。避免溶液暴沸的情况出现，以免影响跑胶效果。冷水冲洗瓶壁略微降温后添加适量核酸染料，摇匀倒入插入梳子的模具中，等待30-60 min凝胶完全凝固即可，尽量在3小时内使用完毕。

②样品准备。样品在从PCR仪中取出后不要急于点样，因为样品刚取出时管内液体和气体温度很高，非常活跃，马上开盖会造成扩增产物弥散到空气中，造成实验室气溶胶污染。所以可以在-20℃冷却5 min，或在4℃冷却20 min再离心上样。样品上样前需要加入上样缓冲液，混匀后取适当的量（5-10微升）缓慢注入梳子孔中，由于上样缓冲液的作用，我们可以清晰看见样品注入的过程，与电泳过程中核酸移动的距离。

③电泳。凝胶带孔的一侧放入负极一侧，因为核酸样品由负极移动向正极，负极一般用黑色表示。电泳槽倒入与凝胶相同的电泳缓冲液，确保电泳槽液面可以没过凝胶表面。必须注意点样开始和完毕后尽量不要移动电泳槽，以免造成样品扩散到电泳液中。点样完毕后静置2 min，如若样品过多，需要加快点样速度，避免先点的样品扩散，影响条带结果。上述工作完成后盖严电泳槽盖，打开电源，电压设置120V左右，跑胶20-30 min即可。注意观察凝胶上染料移动位置，进而减少或增加时间。

④结果判读。取出凝胶放在切胶仪或凝胶成像分析仪上，用紫外灯照射观察、拍照留存条带结果。根据DNA Marker的条带位置比照分析，得出目的条带的位置（大小）、亮度（数量）和非特异性扩增（扩增效果）。

结合上面的介绍，你有没有存在日常操作中对小细节的疏忽呢？琼脂糖凝胶电泳从制备、上样、电泳和结果判读，每一步环环相扣，一点点问题都会体现在最终的结果上。在实验中为了更好的实验效果，远慕生物推出琼脂糖、TAE速溶粉末，核酸染料，上样缓冲液等全套琼脂糖凝胶电泳所需试剂，更有含染料的Taq酶预混液，不用再去加上样缓冲液啦！扩增完成即可直接点样，省时省力，避免污染！