冷冻样本真的不适合做单细胞测序吗？

“单细胞测序”可以说是这几年的一个热门词汇，越来越多的研究者在自己的研究中用到这项技术，大家都知道目前单细胞测序不管是哪个平台，基本还是需要新鲜的活体组织样本，这对于很多研究者来说是难以做到的，虽然目前也有单细胞核测序技术来解决新鲜组织难以获取，或者是一些特殊组织样本难以用活细胞上机的困境，但是很多老师还是担心：冷冻样本会不会不适合单细胞测序呢？冷冻样本获得的数据质量会不会不如新鲜样本呢？ 真相来了，最新的文章研究表明：人类癌症样本的冷冻保存可保留肿瘤异质性，用于单细胞多组学分析。

高通量单细胞RNA测序（scRNA-Seq）已经成为探索复杂人类癌症中细胞异质性的有力工具。使用新鲜手术组织样本进行scRNA-Seq研究，不可能对样本进行组织病理学分类，并限制了进行批量处理的能力。在整合病人数据集时，这种阻碍往往会带来技术上的偏差，并增加实验成本。虽然之前已经探索了组织保存方法来解决此类问题，但在复杂的人体组织上（如实体癌）和高通量scRNA-Seq平台上，它还没有被研究。

利用Chromium 10X平台，对来自三个原发性乳腺癌、两个原发性前列腺癌和一个皮肤黑色素瘤的新鲜和低温保存的复制品共约12万个细胞进行了测序。

三个原发性乳腺癌、两个原发性前列腺癌和一个皮肤黑色素瘤样本，首先将新鲜的手术标本切成1-2mm3的小块并充分混合，其中1/3立即用DMSO在-80℃下冷冻保存，命名为Cryoprerved Tissue（CT），剩下的2/3立刻用成熟的方法解离成单细胞悬液，其中一半单细胞悬液用DMSO在-80℃下冷冻保存，命名为cryopreserved cell suspension（CCS），剩下的一半单细胞悬液立即用10x平台进行scRNA-seq，命名为fresh tissue（FT）。

低温保存的样品，包括CT和CCS，在-80℃下储存约1周后，在-196℃的液氮中储存长达5周，以模仿标准的组织生物库程序。低温保存后，CT和CCS样本被解冻，并以与FT样本相同的方式进行scRNA-Seq处理。

分别对来自乳腺癌患者1-3期（BC-P1、BC-P2和BC-P3），不同处理方式FT、CCS或CT的样本进行了详细的比较，这三种保存方式呈现出一致的 “可混合性”和强烈的重叠性。

研究发现，所有乳腺肿瘤集群中三种保存条件下的细胞均匀分布一致，通过分析典型细胞类型标志物的表达，发现在低温保存的样本中，主要细胞系得到了强有力的保存。

基因表达和转录组的完整性是否在低温保存过程中受到影响，首先检查了每个细胞在低温保存复制中检测到的基因和独特分子标识符（UMI）的数量，M-P1（来自CCS和CO）与FT相比，每个细胞的平均基因数和UMI数较低。同样，只有一个BC-P1样本CT与FT相比，每个细胞检测到的基因和UMI数量明显较低。

接下来调查了FT样品和低温保存样品之间的基因相关性，聚类相关显示出与比较一致的趋势，其中CCS样本显示出比FT样本略高的R2相关性；

这些数据表明CCS样本的scRNA-Seq产生的数据质量略高于CT样本的数据，低温保存可以为scRNA-Seq保存高质量的转录组。

三种不同的样本处理方式在所有癌症病例中检测到的总路径有很好的重叠，在所有病例中，超过64%的所有FT路径在两个冷冻保存的样本中被一致检测到，重叠率最小为64%，最大为77%，虽然这可能反映了基因表达程序可能受到低温保存过程的影响，但这些途径大多是在不同的细胞类型中检测到的，从低温保存样本中检测到的GO路径的高度一致性来看，认为这些微小的差异可能是由于scRNA-Seq平台的变化导致的，而不是低温保存过程导致的。

使用15种典型细胞类型的标记物对一个冷冻保存为CT的乳腺癌病例进行了CITE-Seq。首先使用来自RNA表达的典型标志物的组合来广泛地注释集群。通过CITE-Seq，能够验证细胞类型注释，显示相应细胞类型上典型标志物的高度特异性抗体衍生标签（ADT）表达水平。该研究表明高质量的CITE-Seq免疫分型数据可以从低温保存的CT组织的细胞中产生。这种方法可用于从冷冻临床组织中提取额外的有力的表型信息，有助于单细胞簇的注释和临床相关分子的检测，如免疫检查点。

结论

通过对三种不同条件下的细胞进行了详细分析，以评估冷冻保存对细胞异质性、细胞质量、聚类和基因本体识别的影响。此外，使用CITE-Seq对固体组织碎片冷冻保存的单个乳腺癌样本进行了单细胞免疫分型。从新鲜组织中发现的肿瘤异质性在低温保存的样本中基本保持不变。结果表明，从低温保存的组织或低温保存的单细胞悬液得到的单细胞测序数据与从新鲜组织中得到的细胞测序数据相当，而低温保存的细胞悬液在基因表达方面显示出比新鲜组织更高的相关性，说明低温保存对下游分析的结果（如生物途径富集）的影响很小。对于一些肿瘤，与新鲜保存的组织相比，冷冻保存适度地增加了细胞应激特征。此外，该研究证明了冷冻保存的全细胞对于使用CITE-Seq检测细胞表面蛋白的优势，而使用其他保存方法（如单核测序）是达不到这个效果的。该研究表明可行的人类癌症样本低温保存为多组学分析提供了高质量的单细胞。该研究为组织生物库的新实验设计提供了指导，以用于未来的临床单细胞RNA测序研究。