神经HRP示踪显色液(DAB法)操作步骤

产品简介:
上个世纪70年代，Kristensopn和Olsson报道了HRP可神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，经组织化学方法可显示出神经元的轮廓，从而开发出HRP追踪神经元示踪技术，即为HRP法。DAB即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物，在辣根过氧化物酶的催化下,DAB会产生棕色沉淀，该棕色沉淀不溶于水和乙醇，显色后呈棕色，可在显微镜下观察。
神经HRP示踪显色液(DAB法)是动物经麻醉、注入HRP后，游离或络合型的HRP与氧化剂反应生成络合物，该络合物氧化供氢的DAB显色剂，呈棕色，在显微镜下清晰可见。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
产品组成：
 

名称/编号	R0895	Storage
试剂(A):DABAssayBuffer	2×500ml	RT避光
试剂(B):DAB显色液	30ml	-20℃避光
试剂(C):DAB增强剂	2×1ml	RT
试剂(D):DABWashBuffer(20×)	100ml	RT
使用说明书	1份

 
 
 
 
 
 
 
 

操作步骤(仅供参考):
(一)准备工作
1、动物麻醉：多用(3.5%)戊巴比妥钠作为麻醉剂，大鼠的麻醉剂量为0.25～0.35ml/100g。
2、导入HRP：有压力注射法、电泳法以及周围神经系统的注射涂抹等法。
3、确定动物存活期。
4、动物灌注：麻醉后，经左心室升主动脉插管行心内灌注固定，先用生理盐水或PBS快速灌注；随后用4%的多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，时间控制在30-40min；最后用10%蔗糖磷酸缓冲液(pH7.4)。
5、取材：取组织置于20%的蔗糖磷酸盐缓冲液中，切片厚度40μm，存于蔗糖磷酸盐缓冲液备用。
(二)显色反应
1、配制DAB孵育液：取适量的DABAssayBuffer和DAB显色液，按DABAssayBuffer：
DAB显色液=39:1的比例混合，即为DAB孵育液，即配即用，不宜保存。
2、配制DAB显色工作液：取适量的DAB孵育液和DAB增强剂，按DAB孵育液：DAB增强剂=2000～8000：1的比例混合(具体比例应根据具体时间摸索确定)，即为DAB显色工作液，即配即用，不宜保存。
3、配制1×DABWashBuffer：取适量的DABWashBuffer(20×)，按DABWashBuffer：
蒸馏水=1:19的比例混合，即为1×DABWashBuffer；室温保存，6月有效。
 4、切片用蒸馏水清洗3次，每次2min。
5、切片入10mlDAB孵育液(提前20℃温育)，避光孵育20min，其间不断晃动。
6、切片入10mlDAB显色工作液(提前20℃温育)，避光孵育20min，其间不断晃动。
7、漂洗：取10ml左右的1×DABWashBuffer漂洗切片2～3次，每次5min。
8、贴片，载玻片用铬明矾明胶包被，室温空气干燥。
9、脱水、透明步骤按如下操作：
①蒸馏水10s
②70%乙醇10s
③95%乙醇10s
④100%乙醇2次，每次10s
⑤二甲苯或脱蜡透明液透明2次，每次2～5min。
10、中性树胶封片，显微镜下观察棕色反应。
 
注意事项:
1、如果出现高的反应背景或沉淀，表明DAB底物反应过于强烈。
2、所用器皿必须洁净，避免含有氧化剂或还原剂，否则会产生非特异性反应。
3、DAB显色液避免反复冻融，以免显色效率下降。
4、DAB增强剂注意密闭保存，否则显色效率下降。
 
有效期:12个月有效