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你知道核酸提取加蛋白酶K有什么好处吗?

2022-09-21 9:59 来源:上海远慕生物试剂
随着新冠疫情的发展,新冠病毒核酸的检测工作已趋于常态化。而优质的核酸提取试剂是核酸检测的基础,正确提取核酸才能保证下游检测结果的质量。

市场上核酸提取的试剂成分虽然各有差别,但蛋白酶K由于其独特的广谱蛋白水解酶活性和稳定性,目前已成为了多种提取试剂的重要原料。另外,在临床实践中,特别是我国目前正在推行20混1检测的场景下,难免会遇到复杂样本(例如含有“痰液”的样本);而蛋白酶K在处理特殊样本时,更能突显出作用。
蛋白酶K广泛应用于核酸提取

蛋白酶K来源于林伯氏白色念球菌,是一种丝氨酸蛋白酶,具有较强的稳定性和广谱蛋白水解酶活性,目前广泛应用于核酸提取中。

01、【广谱蛋白水解酶活性】

蛋白酶K可作用于多种蛋白,在病毒核酸提取检测中发挥多重作用:

(1)裂解病毒的外壳蛋白,暴露核酸分子,并且病毒外壳蛋白失活可进一步保证运输和检测阶段更安全;

(2)降解与核酸紧密结合的组蛋白,使得核酸游离到提取液中,有利于进一步纯化;

(3)降解RNA酶,防止病毒RNA的降解,有利于核酸检测。

02、【稳定性】

蛋白酶K能在多种环境[pH(4-12.5),高盐缓冲液,70℃的高温等]中保持活性。另外,蛋白酶K的活性不受SDS、尿素、EDTA、盐酸胍、异硫氰酸胍等的抑制,且一定含量的去垢剂还可以增强蛋白酶K的活性。

03、蛋白酶K在新冠指南、政策文件均有推荐

学术指南和政策文件中,均提及蛋白酶K的应用。

早在2020年4月疫情暴发伊始,中华医学杂志发布了《2019新型冠状病毒核酸检测专家共识》,提出收集痰液于采样杯中,采样杯里需装入2mL蛋白酶K(1g/L)。

2020年7月13日,国务院发布了《医疗机构新冠病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》,文中指出,如果痰液未收集于采样液中,可在检测前,加入2~3mL采样液,或加入与痰液等体积的含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化。

2021年5月,国家卫生健康委员会发布《新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)》,文中提及处理痰液样本时,可采用痰液等体积的含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化。

04、相关研究提示蛋白酶K对复杂样本核酸提取具有重要作用

新冠的核酸采样主要采集口咽拭子和鼻咽拭子样本,但在临床实际工作中,难免会采集到一些复杂样本,例如:痰液等。《2019新型冠状病毒核酸检测专家共识》中引用的研究[4]提示,在复杂样本的提取核酸,使用蛋白酶K效果更佳。

在该研究试验中,SungH等采用了蛋白酶K和其他两种方法,提取痰液标本中的核酸(RNA),并使用荧光PCR仪对三种方法提取的核酸进行分析比较。试验显示,另外两种方法提取核酸检测结果中,假阴性率分别为16.7%和13.3%;使用了蛋白酶K处理的样本,检测结果并无假阴性。另外,蛋白酶K组PCR检测的Ct值范围在31.1-35.4之间,而另外两种方法学PCR检测的Ct值范围分别为34.7-39.0和33.9-38.6。

另外,Saber Khelaifia等对粪便标本中的细菌DNA进行提取,结果显示使用蛋白酶K可以提高DNA的提取量。Tomoo Jikuzono使用蛋白酶K对液基细胞溶液固定的甲状腺细胞进行处理后,提高了RNA回收率。

蛋白酶K增加核酸提取量可能的原因为:

(1)复杂样本(如:痰液样本)中存在着一些可PCR反应的物质(可抑制PCR的物质,例如糖蛋白,免疫球蛋白等物质就是PCR的抑制物),使用了蛋白酶K可最大程度清除该类物质,保证PCR结果准确性;

(2)复杂样本的核酸提取过程中,易残留较多RNA酶,使用蛋白酶K可最大程度灭活RNA酶,防止病毒RNA的降解,有利于核酸检测。

也有一些研究提示,蛋白酶K在复杂样本的处理中并未显示突出作用。这可能与使用的蛋白酶K活性不同有关,另一种可能是与使用场景有关,蛋白酶K加入裂解液之中,若作者长时间放置,蛋白酶K会失活,此时就会得到加不加蛋白酶K没有作用的结论),未来仍需大量研究进一步探索。

目前,新冠疫情依然在全球肆虐,核酸提取检测已趋于常态化。在临床实践中,特别是“10混1”或“20混1”检测的场景下,难免会遇到复杂样本(例如含有“痰液”的样本);而蛋白酶K在处理特殊样本具有独特作用。未来我们需进一步深挖多种提取检测使用场景,探索最佳使用方案,以期更好的控制疫情。
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