蛋白质组学实用分析技术一览

分析其实也属于技术的一部分，且在蛋白质组学研究中显得尤为重要，因为蛋白质组学研究提供的数据是生物学上最庞大的，而且蛋白质组比基因组具有更大的复杂性，因此蛋白质组信息学更有挑战性。今天小编先抛砖引玉地介绍几个常用的分析方法和软件。

蛋白质定性分析

蛋白质定性分析通常是指利用质谱法进行蛋白质鉴定和序列分析。蛋白质定性分析分为top-down分析和bottom-up分析两种策略。目前，bottom-up分析策略被更广泛的应用于蛋白质定性分析工作。

根据使用仪器可分为：MALDI-TOF/TOF、LC-ESI-MS/MS

根据样本类型可分为：蛋白质全谱分析（即shotgun分析） 、蛋白质胶条/混合液分析、蛋白质胶点分析

蛋白质全谱分析

定义：蛋白质全谱分析也可称为质谱shotgun分析，是指组分分析，能够鉴定出尽可能多的肽和蛋白质分子。

原理：将溶液内蛋白质分子或SDS-PAGE条带的复杂混合物酶解成肽段混合物，通过液相色谱分离。串联质谱测试，最后用相应的数据库进行检索匹配，可同时鉴定成百上千种蛋白质。主要应用于某一生理状态下组织、细胞或者细胞器中所有表达蛋白质的鉴定。

蛋白质胶条/混合液鉴定

定义：利用LC-ESI-MS/MS蛋白鉴定技术对胶条样本（即SDS-PAGE样本）、IP、Co-IP、Pull-down等纯化溶液等中等复杂样本进行蛋白鉴定。

原理：利用电喷雾（ESI）技术将样品以离子化的方式从液滴表面蒸发，进入质量分析器。主要应用于蛋白质或多肽鉴定。

蛋白质胶点鉴定

定义：利用MALDI-TOF/TOF蛋白鉴定技术对考/银染的2D或DIGE胶点样本或者较纯的蛋白样本进行蛋白鉴定。

原理： MALDI-TOF/TOF（Matrix – Assisted Laser Desorptiob/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）MALDI的原理是将样品均匀包埋在基质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，从而检测离子。 也主要应用于蛋白质或多肽鉴定。

蛋白质相对定量分析

相对定量的目的是测定目的蛋白在两个或多个样本中的表达量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的表达量。例如，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的蛋白浓度为100%，经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的蛋白含量相对于未处理样品的百分比。

蛋白质绝对定量分析

目前基于质谱的绝对定量蛋白质组学研究主要是指靶向蛋白质组学。靶向蛋白质组学分析，是指对目标蛋白质（或修饰肽段）进行定性和/或定量分析，或者用于验证大规模蛋白质组学的结果。基于质谱的靶向蛋白质组学分析方法，由于没有物种限制并具备多目标同时分析能力等优势，在相关研究领域已逐渐受到越来越多的关注和应用。其技术方法经历了从传统的SRM/MRM（选择性/多反应监视，selected / multiple reaction monitoring）到PRM（平行反应监视，parallel reaction monitoring）的发展历程。

绝对定量蛋白质组学应用方向： 验证定量蛋白质组学结果、验证翻译后修饰蛋白质组学结果、 目标蛋白质绝对/相对定量分析、诊断标志物靶向筛选、诊断标志物验证与绝对定量、验证基因表达产物。

PRM

定义：PRM是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段进行绝对定量。

原理：首先利用四级杆质量分析器的选择检测能力，在一级质谱中（Q1）选择性地检测目标肽段的母离子信息；随后在collision cell中对母离子进行碎裂；最后利用高分辨、高质量精度分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

蛋白质翻译后修饰分析

翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)是指对翻译后的蛋白质进行共价加工的过程，通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团，可以改变蛋白质的理化性质，进而影响蛋白质的空间构象和活性状态、亚细胞定位、折叠及其稳定性以及蛋白质-蛋白质相互作用。许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质的相对丰度控制，更重要的是受到时空特异性和翻译后修饰的调控，揭示翻译后修饰的发生规律是解析蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。常见的翻译后修饰包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等等。

修饰蛋白质组学：质谱是鉴定蛋白质翻译后修饰的重要方法，其原理是利用蛋白质发生修饰后的质量偏移来实现翻译后修饰位点的鉴定；同时，由于翻译后修饰的蛋白质在样本中含量低且动态范围广，检测前需要对发生修饰的蛋白质或肽段进行富集，然后再进行质谱鉴定。

蛋白质组学生物信息学主要内容：

蛋白功能注释：亚细胞结构定位、GO分类、KEGG通路途径、蛋白结构域、KOG/COG分类、FunCate2分类。

功能富集分析：使用费歇尔确切检验方法，描述特定属性蛋白群体（差异表达的蛋白、发生修饰的蛋白等）潜在调控的生理过程。分析包含：GO分类富集、KEGG通路富集、蛋白结构域富集、蛋白复合物富集。

功能富集聚类分析：使用分层聚类的方法，研究不同实验处理条件下对特定属性全蛋白群体调控生理过程的影响。

表达模式聚类分析：使用Mfuzz聚类方法对蛋白在不同处理条件（不同处理时间或药物浓度）下表达谱的聚类分析。直观的反应出处理时间或药物浓度与蛋白表 达水平的关系。对得到的不同表达模式分类可以做进一步的功能富集聚类分析，揭示药物潜在作用的蛋白与生理功能。

修饰位点motif分析：分析翻译后修饰位点附近氨基酸分布情况，预测潜在与该种修饰类型相关的保守序列区间。通过与蛋白结构域的联系，为研究该种修饰类型作用和调控机制研究提供参考依据。