ELISA显色淡的原因竟是这些！

　　显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显**况适当缩短或延长反应时间，及时判断。

　　OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。

　　TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达ding峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。

　　elisa实验之比色

　　比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。

　　比色结果的表达以往通用光密度（oplicaldensity，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。

　　ELISA显色淡的原因如下：

　　原因一：试剂盒在运输途中时间太长，温度太高。

　　解决方案：尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温。

　　原因二：试剂盒未充分平衡。

　　解决方案：试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）。

　　原因三：培养箱温度不足37℃。

　　解决方案：注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定，非隔水式培养箱尤其应注意。

　　原因四：保温时间不足。

　　解决方案：校正定时钟准确定时。

　　原因五：洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加。

　　解决方案：按说明书要求保留洗涤时间，准确记住洗涤次数。

　　原因六：移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁。

　　解决方案：校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，一次性使用。

　　原因七：蒸馏水水质有问题。

　　解决方案：使用新鲜合格的蒸馏。

　　原因八：底物作用时间不足。

　　解决方案：准确定时。

　　显色一定要控制时间，根据试剂盒说明操作即可。一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。