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你知道多肽合成是怎么样建立的吗?

2021-11-23 10:45 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂
多肽固相合成法是多肽合成有机化学的一个重大的提升。它的最大的优点是不必纯化中间物质,合成过程能够连续开展,从而为多肽合成的自动化奠定了基本。目前全自动多肽的合成,基本上全是固相合成。其主要过程以下:

根据Fmoc化学合成,先将所需合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不可溶的高分子树脂相接,然后以这一氨基酸的氨基做为多肽合成的起始点,同其他的氨基酸早已活化的羧基功效产生肽键,持续重复这一过程,就可以获得多肽。依据多肽的氨基酸构成不一样,多肽后处理方法不一样,纯化方法也是有差别。


1.做免疫用的多肽多长为合适?
一般约10-15个氨基酸,自然长一些免疫效果非常的好一些,但是合成费用也会提升。MAP多肽则期待长短在15aa之上,实际效果不错。此外,10aa下列的多肽免疫实际效果非常差。

2.免疫用多肽的纯度必须很高吗?
一般而言,免疫用Peptide,70-85%就可以。

3.大家合成的多肽溶解性不太好,多肽就有问题对不对?
难以准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。假如多肽无法溶解就觉得多肽合成有问题这一观念并有误。

4.多肽情况是怎样?如何保存存储?
大家带来的多肽是粉状,一般为灰白,构成不一样,多肽粉末状的色调有差别,多肽一般长期性储存必须遮光储存,并应储存在-20度,短期内能够储存在4度。能够短期内得话是以室内温度运送。

5.怎样溶解多肽
溶解多肽是比较复杂的事儿,一般难以一下子明确合适的有机溶剂。一般是先取一点实验,在都没有明确合适的有机溶剂前千万别合部溶解。以下方式有利于您挑选合适的有机溶剂:
(1)判断多肽的正电荷特殊,设置酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH为-1;碱性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2为+1,其他氨基酸的正电荷为0。测算出将电荷数。
(2)假如净电荷数>0,多肽为碱性,自来水溶解:如果不溶解或溶解性并不大,加入醋酸(10%之上);假如多肽还不能溶解,加入少量TFA(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。
(3)假如净电荷数<0,多肽为酸性,自来水溶解;如果不溶解或溶解性并不大,加入氨水(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。
(4)假如净电荷数=0,多肽为中性,一般必须用有机溶剂如乙腈,甲醇或异丙醇,DMSO等溶解。也有人建议必须尿素来溶解疏水性非常大的多肽。

6.非HPLC纯化的多肽中有什么杂质?
粗品和除盐等级的多肽中多肽和非多肽类杂质:如非总长多肽和多肽后处理的一些原材料如DTT、TFA等。

7.HPLC纯化的多肽有什么杂质?
历经HPLC纯化的多肽,仍会出现一些一些杂质存有,在其中的杂质主要是短肽和少量TFA。

8.多长的多肽为合适?
多肽合成必须考虑到多肽的长短,正电荷,亲疏有别水溶性等要素。长短越长,合成粗品的纯度和产出率都随之减少,纯化的困难和没法合成的概率便会大些。自然多肽功能分区的编码序列是难以更改的,可是为了更好地多肽的顺利合成,有时候必须在作用取的上中下游提升一些辅助氨基酸,以改进多肽的溶解性和亲疏有别水溶性。假如多肽过短,合成也很有可能有问题,关键情况是合成的多肽后面处理方式中有一定的难度系数,5肽下列的多肽,一般要有亲水性的氨基酸,不然后处理难度系数增加。15个氨基酸残基下列的多肽一般都能够取得认可的产出率和得率。

9.怎样从多肽编码序列中判断多肽的溶解性?
(1)多肽中假如带有高比率的疏水性较强的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp,多肽难以溶解与水溶性水溶液中或压根不太可能溶解。这种氨基酸不论是纯化或合成,都是有很有可能有问题。
(2)一般状况下疏水性氨基酸的占比<50%,不可以连续5个连续aa为疏水性,带正电荷的氨基酸的(正电K,R,H,N-terminus,负电D,E,C-terminus)的占比做到20%,在多肽的N或C短假如能提升旋光性氨基酸,还可以改进溶解性。

10.为何带有Cys,Met,或Trp的多肽难合成?
带有Cys,Met,或Trp的多肽无法合成,与此同时难以获得高纯的商品。关键是因为这种官能团不稳定,易空气氧化。这种多肽的应用和存储都必须需注意,防止不断打开外盖。

11.为何有一些多肽的合成产出率或纯度会非常低?
多肽合成与引子合成有非常大的差别,不可以合成的引子非常少,可是不可以合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr这种氨基酸邻或重复时,多肽链在合成过程中无法完全舒展溶解,合成效率降低。下列多种情况,合成效率和物质的纯度都非常低,如:重复Pro,Ser-Ser,重复Asp,4个连续Gly等。

12.多肽是怎样纯化的?
多肽纯化一般应用正相反柱(如C8,C18等),214nm。缓存管理体系一般为含TFA的有机溶剂,pH2.0。BufferA为含0.1%TFAinddH2O,BufferB为1%TFA/ACN/pH2.0。纯化前用BufferA溶解;假如溶解不太好,用BufferB溶解后,然后用BufferA稀释;对疏水性强的多肽,有时候还必须加入少量的FormicAcid或醋酸。HPLC剖析多肽粗物质,假如多肽不长(15aa下列),一般会出现主峰,主峰一般为总长物质;针对20aa之上的长肽,要是没有主峰,HPLC需配搭Mass来判断相对分子质量,从而明确哪个峰是所需合成的多肽。
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