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免疫定量分析中标准品的制备

2021-09-14 10:57 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂
标准品是标记免疫分析定量的依据。标准品的正确与否直接影响样品的测定结果。如果在连续测定中,或各实验室之间使用的标准品不一致,则可影响到实验结果的可比性。为此,对标记免疫分析所使用的标准品应满足如下要求。

一、标准品的要求

1、化学结构:原则上标准品应与被测物具有完全相同的化学结构,包括相同的立体化学结构。但在实际工作中,用化学结构完全相同的物质作标准品是十分困难的。这是由于一方面来源有限,另一方面有些被测物本身的化学结构还不清楚,或是有明显的异型性。所以有时也用结构类似的物质作标准品。此时,应充分了解这些物质与真正标准品之间的定量关系。

2、化学纯度:所有通过化学合成法制备的小分子化合物,都应是高化学纯度的纯品。对某些蛋白类物质,则可能由于纯化的方法不同而有差异。对此,在最初建立该方法时,应与国际上公认的标准参考品或高纯度的纯品进行比对。

3、免疫纯度:标记免疫分析是通过比较被测物质与标准品的免疫活性实现的,故被测物质与标准品对所用抗体的免疫活性应该完全一致,即两者对所用的同一抗体有完全相同的亲和力。因此,标准品的免疫纯度比其化学纯度更重要。

4、反应介质:免疫学反应受反应介质和温度等条件的影响,所以理论上要求标准品和被测物应在完全相同的介质中进行反应。如测定血清中某物质的浓度,其所用的标准品也应溶解在无被测物的零值血清中;如测定尿液中某物质的浓度,其所用的标准品也应溶解在无被测物的尿液中等。但在实际工作中这一点很难做到。因为,血清中的成分十分复杂,因而无被测物的零值血清的制备非常困难,而且个体血清中还可能存在一些干扰物质。理想的标准品应该用与被测样品相同的基质(如血清),先将被测物质完全去除,然后再加入已知量的被测物质的纯品。

5、干扰物质:标准品中不能有干扰分析的物质。在作为标准品使用前,必须对那些从机体提取到的大分子物质活性进行测定。

6、标准品的批量:为保证检测的连续可比性,每批标准品应有相当大的量,以保证在较长的时间内使用。每批标准品如保存的条件适当,在相当长的时间内可保持其浓度和免疫活性的稳定。这对于生产标记免疫分析试剂的厂家尤为重要。

二、标准品的分级

所谓标准品在英语中有三个名词,即标准品 (standard)、校准品(calibrator)和参考品(reference)。这三个名词的意义不完全相同,但在国内它们则经常被混淆。目前在我国的标记免疫分析实践中,所谓的"标准品"实际上是指校准品。为使用方便先仍用"标准品一词"。

有关标准品可分为如下的等级:

【国际参考品(international reference)】:国际参考品是由WHO指定的实验室制备,并与有关国家的一定机构联系(在我国是卫生部药品与生物制品检定所),被国际公认为最高级别的标准品。到目前为止,与标记免疫分析有关的已达数十种。但由于标记免疫分析方法的迅速发展,很多标记免疫分析方法还没有国际参考品。

【国家级标准品】:国家级标准品是由国家的有关权威机构,用高化学纯和高免疫纯、低交叉反应的纯品制备的,供国家内部使用。国家级标准品应与国际参考品或其他国家的国家级标准品进行比对。我国现已有国家级标准品数种,如胰岛素(insulin)、绒毛膜促性腺素(hCG)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、肝胆酸(CG)、甲胎蛋白(AFP) 等。

【实验室标准】:实验室标准是由实验室自己,或由生产厂家制备的标准品,又称二级标准品。所有的二级标准品都必须经过与国家标准品或国际参考品进行比对或校正。如没有国际参考品或国家级标准品的,也应与国际公认的生产厂家的标准品进行比对。

三、标准品的制备、鉴定、与计量

1、标准品的制备:标准品的制备是非常复杂的问题,也是标记免疫分析中比较难于制备的一个成分。以下讨论的是实验室标准品(或商品化试剂中标准品)的制备。

(1)基质的制备:如前所述,作为标准品的介质(基质)成分应与被测样品相同。对大多数用于测定血清中某物质的标准品,应用不含被测物质的零血清制备,以求反应的介质环境相当。但有时零值血清的制备十分困难,所以有些标准品用适当的缓冲液制备,并在缓冲液中加入一定量的载体蛋白(一般用1%~2%的牛血清白蛋白),以便使其与样品的介质环境相近。

零值血清的制备方法有:

A、吸附法:血清中小分子物质如三碘甲状腺原氨酸 (T3)、甲状腺素(T4)等,可用活性炭吸附去除。这种方法简便,但待测物质难以清除干净,而且大分子活性物质不能用此法进行制备。

B、反复冻融法:对大分子活性物质可选用低值血清,经反复冻融使被测物质失活。用这种方法可使某些蛋白类激素大部分失活,但也难以得到真正的零值血清。

C、亲和层析法:用特异性抗体制备亲和层析柱,用以吸附被测抗原。用这种方法可以得到高质量的零值血清,但本法比较复杂而且成本也高。

(2)标准物纯品的选择:应选择高化学纯和高免疫纯的纯品作标准品。其中免疫纯尤为重要,在标准品中不应含有与被测物质有交叉反应的物质。

(3)标准品的制备:先用零值血清配置高浓度的标准品,然后根据实验系统的要求,用零值血清将高值血清稀释至应有的浓度,制成符合预定要求的,由不同浓度组成的系列标准品。

2、标准品的鉴定

(1)免疫活性的鉴定:选用高特异性的抗血清分别作公认标准品(如WHO的国际参考品或国家标准品)的待鉴定标准品的剂量反应曲线,并观察两条曲线的平行性。如两条剂量反应曲线平行,说明两种物质对同一抗体有相同的亲和力,即二者是同质性物质。如两条剂量反应曲线不平行,说明两种物质具有异质性,因而这一待鉴定的标准品是不能使用的。

(2)浓度的标定:用已鉴定过的,免疫活性合格的标准品,与公认的标准品作浓度相同的剂量反应曲线。此时,两条剂量反应曲线应该是基本重合的。如果两者平行但不重合,则取两条剂量反应曲线的50%结合处的相应剂量( ED50 )计算二者的换算系数,然后调整待鉴定标准品的浓度,直至使两条剂量反应曲线完全或基本重合为止。

3、标准品的计量:许多小分子抗原或半抗原已能得到纯品或进行合成,它们对作为标准品的要求可以得到基本的满足,其计量多直接用单位体积中的重量表示,如mg / ml、ng / ml 、pg / ml等。最近WHO推荐用质量单位取代重量单位,即mol / L、mmol / L、或nmol / L等。对大分子的活性物质则比较复杂。由于得不到绝对的纯品,故很难直接用单位体积中的重量或单位体积中的质量计量。因此,常用该物质的生物活性单位表示,如IU / L、mIU / L等。

四、标准品的稳定性与保存

如前所述,为保证检测的连续可比性,每批标准品应有相当大的量,以保证能在较长时间内使用。因此,每批标准品应在适当的条件下保存,使其免疫活性和浓度保持稳定。

1、影响标准品稳定的因素

(1)基质中的酶、细菌污染、pH的变化、氧化、潮湿等因素都可以导致标准品的变性,而且这些变化可因高温和光照加速。

(2)在保存过程中发生聚合反应等分子结构的变化,可使标准品失活。

(3)容器内壁的吸附作用和溶剂的蒸发可造成标准品浓度的改变。

(4)保存条件不适当也可以影响标准品的稳定性,如反复的冻融可降低标准品的免疫活性等。

2、标准品的保存方法

(1)冷冻干燥法:冷冻干燥对标准品的浓度和免疫活性无明显的影响,是目前最常用的保存方法。冷冻干燥制品在低温下,可在较长的时间内保持稳定。但应用冷冻干燥制品时,复溶体积的准确度十分重要。因此,要用经过校准的量器准确的复溶,以减少标准品的浓度误差。

(2)在标准品中加一定量的防腐剂可减少细菌污染的影响。

(3)密闭真空保存或充入惰性气体等方法也可以增加标准品的稳定性。 目前最常用的方法是:在标准品中加入少量的防腐剂(如0.1%叠氮钠或0.1%硫柳汞),冷冻干燥后密封,并在低温下保存。但应注意,一旦复溶后应放低温保存,并不得反复冻溶。复溶后的标准品其有效期明显缩短,一般不超过6~8周,有些物质可能更短。
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