什么是细胞培养​：​基础知识、设备、基本原理

什么是细胞培养？细胞培养是指从动物或植物中提取细胞，然后在人工环境中进行培养以进行科学研究。最早的细胞培养技术是在100多年前开发的，为科学的巨大突破做出了贡献。如今，它已成为全世界实验室用于研究细胞的生理学、生物化学、疾病潜在机制以及药物和有毒化合物的作用的基本工具。它也可用于在药物筛选和大规模制造生物化合物，诸如疫苗和治疗性蛋白质。

细胞培养实验室设计

任何细胞培养都需要几个重要的注意事项。最重要的方面是维持无菌和无菌环境，以防止细胞污染。首先，应使用一个单独的封闭房间或带有一个进出点的实验室。应在实验室入口和出口附近设置带有肥皂和消毒剂的洗手水槽，以进行手部清洁。专用细胞培养实验室外套和安全镜应放在实验室入口处。层流罩和培养箱应远离入口，以最大程度地减少污染风险。将通风橱和培养箱放置在远离任何空调单元的位置，以防止可能被污染的气流进入无菌工作环境和培养箱中，这一点也很重要。应该有足够的清洁工作表面，需要定期进行消毒，并要有足够的存储空间，以确保工作表面保持清洁。实验室内所有必要的设备和消耗品均应可触及，以防止退出和再次进入。人体工程学环境对于层流罩非常重要，因为层流罩在工作时应有足够的空间放置物品或可移动的消耗品推车，并且易于接近培养箱，显微镜和离心机。

细胞培养安全

细胞培养实验室会带来处理和操纵细胞和组织以及有毒，腐蚀性或诱变性溶剂和试剂有关的风险。因此，遵守标准的微生物实践和技术对于降低风险和确保安全至关重要。生物安全有四个级别，称为生物安全级别（BSL）。每个级别都有相应的微生物标准、安全设备和设施防护措施，在处理有害生物材料和有害物质时应予以实施。BSL-1是大多数研究和临床实验室所共有的基本保护水平，在这些实验室中，所使用的药物尚无法在正常健康的人类中引起疾病。BSL-2适用于已知中度风险的药物，已知这些中度风险的药物通过摄入或经皮或粘膜暴露可导致严重程度不同的人类疾病。大多数细胞培养实验室应至少为BSL-2，但具体要求取决于所用生物材料和所进行工作的类型。造成严重且可能致命感染的细胞或试剂需要BSL-3，而BSL-4实验室则需要密闭程度最高。

以下是细胞培养实验室的基本安全建议列表。清单不完整，应补充适当的生物安全水平建议。

始终穿戴适当的个人防护设备（PPE），包括实验室外套，手套和护目镜。

务必阅读所使用的任何物质的材料安全数据表（MSDS），以确保在处理时采

适当的安全预防措施。

在实验之前和之后对所有工作表面进行消毒。

即使没有受到污染，也应定期清洁实验室设备。

避免产生气溶胶或飞溅物。

在使用有潜在危险的材料之后以及离开实验室之前，请洗手。

在处置之前，对所有潜在的传染性材料进行消毒。

将可能导致传染性物质暴露的任何事件报告给适当的人员（例如，实验室主管，安全员）。

请勿在实验室中饮食，抽烟，吸烟，戴隐形眼镜，涂抹化妆品或存放食物以供人类食用。

细胞培养基础 培养条件

对于细胞存活和生长，至关重要的是培养环境尽可能复制细胞的生理环境。可以控制的培养条件包括温度、相对湿度和二氧化碳含量，以及与培养基相关的因素，例如营养成分、pH、分子渗透摩尔浓度以及补料的体积和使用频率。这些变量会随时间波动，因此应对其 进行监视。

原代细胞与永生细胞

原代细胞培养是直接从完整或分离的组织或器官片段中分离并在培养皿中生长的细胞。首次将原代培养物进行传代培养后，它就被称为细胞系。原代细胞系的寿命有限，在达到衰老状态（细胞分裂停止）之前只能传代培养10至20次。

一些细胞系的寿命没有限制，并且具有无限的增殖能力。这些细胞系被称为连续的或永生的细胞系。细胞的永生化可以多种方式发生。癌细胞具有固有的突变，使细胞能够不受限制地繁殖。最初具有有限寿命的正常细胞可以通过促进生长的基因突变而转化为永生化细胞。通过化学处理或引入可激活生长促进基因的致瘤病毒，也可使在培养物中生长的正常细胞永生。

贴壁培养与悬浮培养

贴壁细胞附着于细胞培养容器表面，进行单层细胞生长。传代时，需要使用剥离剂将其从表面剥离。传代后几个小时内，它们会重新附着在表面上。悬浮细胞不会在细胞培养容器的表面形成单层，而是保持悬浮状态。细胞可能会形成团块，尤其是高密度时。

哺乳动物与非哺乳动物细胞培养

哺乳动物细胞培养是最常见的，但是，可以培养的细胞来自多种生物细胞，例如植物，昆虫，细菌和酵母。植物细胞培养物通常在液体培养基中作为细胞悬浮培养物或在固体培养基中作为愈伤组织培养物生长。源自果蝇（Drosophila melanogaster）或粘虫（Spodoptera frugiperda）的细胞是昆虫细胞系的典型实例，其分别用于生化测定或重组蛋白的表达。对于细菌和酵母菌，通常会在含有嵌入营养物的固体支持物（通常是凝胶，如琼脂）上培养少量细胞，细胞悬浮培养需要在营养培养基的条件下进行大规模培养。

细胞生长与融合

细胞培养物的生长通常分为四个阶段（如下图2）。当细胞适应培养条件且未分裂时，就会发生滞后阶段。对数阶段发生在细胞生长活跃分裂时。这是细胞实验和数据收集的最佳阶段。当细胞达到对数后期时，应进行传代培养。这是在“人满为患”之前发生的。当细胞接近拥挤时，细胞生长会减慢。这被称为固定相或平稳期。此阶段的细胞处于细胞应激的风险中。当细胞死亡的自然过程占主导地位时，细胞群被认为处于死亡阶段，也称为衰退阶段。

细胞系选择

世界各地的实验室中使用了成千上万种成熟细胞系，可以从商业或非营利性供应商（细胞库）购买。从经过验证的细胞库无污染的角度出发，从信誉良好的供应商那里获得细胞系至关重要。从其他实验室获得细胞系具有很高的污染风险，并且缺乏细胞系验证，因此建议您不要这样做。

标准细胞培养方案

在所有细胞培养实验室中都有几种基本的细胞培养方案。熟悉并理解这些操作标准（SOP）很重要。

无菌技术

始终如一地进行无菌技术的操作可以帮助确保所有培养基和培养皿的无菌性，从而减少细胞暴露于污染物的机会，并保持培养物健康，可行和纯净。严格的无菌技术是成功进行细胞培养以使培养物免受微生物污染和细胞交叉污染的必不可少的先决条件。

原代细胞分离

原代细胞分离可以在多种复杂的生物学样品上进行，包括组织（皮肤，肝脏，肿瘤，脑，肺等），骨髓，血液，脾脏和淋巴结。有许多不同的方法可以制备样品以获得最佳的细胞分离效果。选择的方法取决于您的起始样品，可能涉及从样品中除去某些元素或仅创建单细胞悬液。从完整组织中分离细胞时，必须首先使用机械力或蛋白水解酶破坏将细胞固定在一起的细胞外基质。

原代细胞分离的基本原理要求将分离出的组织切碎或用无菌剪刀或手术刀切成2-4毫米的碎片。将薄纸片加上适当的缓冲液或平衡盐溶液中，洗涤2-3次。根据方案添加解离酶并孵育。通过轻轻移液将细胞分散。通过细筛过滤细胞悬浮液，并洗涤2-3次。将细胞重悬于培养基中并接种。

传代细胞

传代培养或传代是指稀释已达到高度融合的细胞以使其能够连续培养。贴壁细胞在80-90％汇合时应传代，悬浮细胞应在细胞结块且混浊时传代。记录每个细胞系的细胞传代数非常重要。这有助于监视原细胞活力并在其达到衰老之前计划实验。随着传代次数越高，遗传漂移越远，它有助于监测永生细胞的年龄。不应对传代数很高的细胞系进行实验。

始终轻柔地处理细胞非常重要，因为剧烈或严厉的处理可能会导致细胞损坏或死亡。切勿用移液器直接吸取培养基或将缓冲液直接洗涤到细胞上，请始终将其轻轻地添加到容器侧面，以免损坏细胞。当重悬沉淀或研磨混合细胞时，请轻柔地进行。

简而言之，贴壁细胞的传代培养方案如下：去除培养基，并用PBS洗涤细胞一次。加入分离剂，例如胰蛋白酶（分解使细胞粘附到血管上的蛋白质），然后将细胞在37°C下温育直至完全分离。分离可能需要1-20分钟，具体时间取决于细胞系。在显微镜下监控细胞，以确定何时发生分离。通过向细胞中添加完整的培养基使胰蛋白酶失活（血清中的胰蛋白酶含有蛋白酶抑制剂使胰蛋白酶失活），然后在离心机中离心（150–300g，3-5分钟）使细胞沉淀。除去培养基（沉淀上部的液体），将细胞轻轻重悬在新鲜培养基中，然后将细胞以所需密度铺在新的培养皿中。对于悬浮细胞，不需要胰蛋白酶。收集细胞并离心（在150–300g下离心3-5分钟）形成沉淀，除去培养基，将细胞重悬于PBS中进行洗涤。在另一轮离心后除去缓冲液，将细胞重悬于新鲜培养基中，并以所需密度重新接种。

冷冻保存和复苏

细胞系是宝贵的资源，因此保存库存以进行长期存储至关重要。冷冻保存是指在非常低的温度下冷却和保存细胞以保持其生存能力的过程。细胞库适合在低于-130°C的温度下长期保存。

冷冻保存培养细胞的最佳方法是在冷冻保护剂（例如DMSO）存在的情况下，将它们保存在完全培养基中的液氮中。防冻剂降低培养基的凝固点，还可以降低冷却速度，从而大大降低形成冰晶的风险，而冰晶可能损坏细胞并导致细胞死亡。细胞应以高浓度（例如90％融合时）和最早的传代次数进行冷冻保存。简而言之，冷冻保存包括洗涤和沉淀细胞，将其重悬于含有DMSO（例如5％DMSO）的完全培养基中，并将细胞悬浮液转移至1mL无菌冷冻管中。由于细胞必须缓慢冷冻，因此将冷冻管放置在可控速率的冷冻室或冷冻室中。将冷冻冷冻的容器在-50至-80°C的温度下储存24小时，然后将冷冻管转移到液氮储存器中。

确切的冷冻条件取决于使用的细胞系。检查特定于细胞系的条件非常重要，否则冷冻的种子细胞在复苏和再培养时可能不会产生活细胞。

为了从液氮储存中恢复细胞系，将冷冻的小瓶在便携式液氮容器或干冰中运输到细胞培养区域。冷冻小管中的DMSO一旦融化，会对细胞产生毒性，因此，为确保高细胞活力，必须在37°C水浴中迅速融化细胞，并立即将其转移到装有预热培养基的培养皿中。培养基稀释了DMSO，因此细胞不再处于有毒浓度。一旦复苏的细胞繁殖并传代两次，它们就可以用于实验。比较好的作法是尽快冷冻储存更多细胞，并更换长期存储的细胞。