支原体染色检测试剂盒操作步骤

产品名称：支原体染色检测试剂盒
规格：100T
保存条件：—20℃,避光,12个月
用途：通过染色检测培养细胞中是否存在支原体污染。
注意事项：通过Hoechst染色来检测支原体的。本试剂盒的荧光染色可快速、有效、高灵敏度地检测支原体污染。

产品简介：
支原体染色检测试剂盒(Mycoplasma Stain Assay Kit)是一种经典的利用 DNA 荧光染色法检测支原体污染的试剂盒，其原理在于。当细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst33258 染色后在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。

Hoechst Staining Kit 经常用于培养的贴壁或悬浮细胞以及组织切片的细胞凋亡检测。该试剂盒检测细胞含量范围一般为 0.1～1×106 之间。

自备材料：
1、 可观察蓝光的荧光显微镜或激光共聚焦显微镜
2、 PBS 或生理盐水
3、 载玻片、盖玻片
4、 预冷固定液：预冷的 70%乙醇或 4%多聚甲醛
 
操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁细胞
1、取洁净盖玻片在 70%乙醇中浸泡 5 分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的 PBS
或生理盐水洗涤 3 次，再用细胞培养液洗涤 1 次。将盖玻片置于 6 孔板或其他培养皿内，接种细胞培养过夜，使融合率约为 50%～80%。
2、加入干预条件使细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入 Hoechst 固定液 0.5ml，固定 10分钟或更长时间(可 4℃过夜)。
3、去除固定液，用 PBS 或生理盐水洗 2 次，每次 3min，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。
4、加入 Hoechst 33258 染色液 0.5ml，孵育 5min。也宜用摇床，或手动晃动数次。
5、弃染色液，用 PBS 或生理盐水洗 2 次，每次 3min，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。
6、滴一滴抗荧封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，尽量避免气泡。
7、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长 350nm 左右，发射波长 460nm 左右。

(二)悬浮细胞
1、离心收集细胞样品于 1.5ml 离心管内并弃液，加入 Hoechst 固定液 0.5ml，缓缓悬起细胞，固定 10min 或更长时间(亦可 4℃过夜)。
2、低速离心去除固定液，用 PBS 或生理盐水洗 2 次，每次 3min。洗涤时手动晃动数次。
3、低速离心离心后吸去大部分液体保留约 50μl 液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

4、稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
5、均匀滴上 Hoechst 33258 染色液 0.5ml，孵育 5 分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。
6、弃染色液，用 PBS 或生理盐水洗 2 次，每次 3min，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。
7、滴一滴抗荧光封片剂于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
8、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。 激发波长 350nm 左右，发射波长 460nm 左右。

(三)组织切片
1、常规包埋切片。
2、用 PBS 或生理盐水洗 2 次，每次 3min。洗涤时手动晃动数次。
3、均匀滴上 Hoechst 33258 染色液 0.5ml，孵育 5 分钟。
4、弃染色液，用 PBS 或生理盐水洗 2 次，每次 3min，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。
7、将切片置于载玻片上，滴一滴抗荧光封片剂，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
8、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长 350nm 左右，发射波长 460nm 左右。
 
注意事项：
1、 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。使用抗荧封片剂时也应避光操作。
2、 在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离心时间。
3、 Hoechst 33258 染色液对人体有一定刺激性，请注意适当防护。
4、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
 
有效期： 12 个月有效。亦可 4℃保存, 1 个月有效。