掌握这些，一体化免疫荧光技术不用愁

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

一、传统的免疫荧光实验步骤

（一）、实验材料
细胞样品
试剂、试剂盒：多聚甲醛、70 % 甲醇、丙酮、PBS、Triton 、BSA、DAPI 染液、DABCO、Tris、甘油
仪器、耗材：玻片

（二）、实验步骤
细胞爬片免疫荧光实验步骤：

第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min。
2. 用 4 % 的多聚甲 Quan 固定爬片 15 min， PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min。
3. 0.5 % Triton X-100( PBS  配制 ) 室温通透 20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）。
4. PBS  浸洗玻片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭 30 min。
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4 ℃ 孵育过夜。

第二天：
6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中 20~37 ℃ 孵育 1 h，PBST 浸洗切片 3 次，每次 3 min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加 DAPI 避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBST 5 min × 4 次洗去多余的 DAPI。
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

二、传统免疫荧光实验主要问题
爬片效果欠佳
细胞和试剂用量大，成本高
染液分布不均
操作繁琐, 费时费力