远慕实验：细胞培养周期实验要点！

1、原理：细胞在有丝分裂的过程中DNA会复制扩增加倍，为原来的1-2倍。PI染色DNA后，通过检测DNA的量来判断细胞周期状态。G1期细胞主要进行RNA和蛋白的合成， DNA数目为n。S期DNA开始复制，直到复制结束进入M期，DNA数目为n-2n。G2期主要是RNA和蛋白的合成,为M期做准备 DNA数目为2n 。M期细胞分裂的过程，直到M结束细胞一分为二，DNA数目也是2n。从DNA的数目上，我们可以将细胞周期分为G0/G1期，S期，G2/M期.

2、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加EDTA，充分使细胞消化成单个细胞，因为细胞成团会被流式细胞仪误检测成多倍体，从而使结果中G2/M期细胞比例增加。

3．细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎。

3、细胞用PBS洗涤离心，转速不超过1000r/min，有文献用800r/min；可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以 减少细胞与尼龙网粘连的损失，本人觉得钢网易损伤细胞，DNA外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首选尼龙网）。

4、离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精，而不是向细胞中加酒精，这样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！

5、一般选择4℃固定过夜，固定时间不要超过24小时。

6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题。

7、关于PI染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为DNA染色剂）的浓度从0.5μg/ml,20μg/ml，到50μg/ml都见报道。RNAs酶（由于PI也可染RNA，用RNA酶降解RNA，从而PI染色能精准的反应DNA的含量。）一般浓度为50μg/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。

8、检测时细胞要达到1～2×10^6个细胞（实际检测是1-5万个细胞左右），为了既保持初始条件相同，又可收集到足够的细胞，应选用多孔培养板，在收集细胞时，浓度大、抑制强的组可多收集些孔，以保证检测的细胞数量。如果细胞数量太低，技师就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！
9、周期结果图中各相峰高耸，各期分开清楚显示较好的结果。