细胞冻存经验之谈！

细胞冻存是将细胞储存在低温环境中，减少细胞代谢，实现长期储存的一种技术。在大多数细胞系中，细胞会随着衰老和演化不断的积累改变，造成表型和基因型的“培养漂移”，在冻存过程中，适当的操作和合适的冻存条件可以减少细胞特性的改变或丢失，起到细胞保种的作用。因而，正确且成功的冻存对于细胞的长久应用起着非常重要的作用。

01、正确的培养和温和的细胞收集

在冻存前，细胞应保持最佳的生长状态(处于对数期或指数期)，理想情况下，培养基应在收获前24h更换。建议对培养物进行微生物污染物检测，特别是支原体，确保细胞没有任何的污染。在细胞的收集过程中，实验操作要尽可能的温和，避免细胞受损。

02、适当的低温保护剂

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞，减少在冷冻过程中对细胞的损害。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冻存，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。

聚乙烯基吡咯烷酮、乙二醇、甲醇和甲基乙酰胺等都是低温保护剂。在细胞冻存中最常见的是二甲基亚砜(DMSO)和甘油，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，关键在于对细胞无明显毒性。DMSO通常浓度为5 - 10% (v/v)，最佳浓度随细胞系的不同而不同。甘油在冷冻介质中的最终浓度为5 - 15%，同样，最佳浓度取决于细胞系。为了提高较难保存的细胞的存活率，冻存时可以选择增加保存液中的血清浓度。想要冻存细胞更快更稳，细胞冻存液会是不错的选择，无需配制，直接在细胞中加入适量的冻存液即可，操作简单，就能拥有高活率的细胞。

03、缓慢的冻存速度

慢速冻存对细胞活力的恢复是非常重要的。对大多数动物细胞，每分钟降低-1到-3℃能让细胞更好适应冻存状态。目前大多数实验室常用的方法是梯度降温法：在4℃放置30 min，再转入-20℃存放 2h，接着转入-80℃冰箱冷冻过夜，次日将冻存管转移到液氮罐中长期保存。一款可重复使用的细胞冻存盒，可省去多次反复转移细胞的时间，将准备好的细胞冻存管放进冻存盒，直接在-80℃过夜后就可以转移至液氮罐中。无论使用哪种冻存方法，重要的是在转移存放位置的过程中一定要迅速，转移时建议将冻存管放在干冰中恒温，尽量避免转移过程因温度变化对细胞活力的影响。

04、持续的低温储存

细胞温度应始终保持在-130℃以下，才能达到最佳存活率。如果存放温度控制不好，存活率会随着时间的推移而降低。建议将细胞在液氮条件下长期保存，需要定期人工检查液氮罐的密闭性和液氮量是否充足，避免因储存条件造成细胞的损毁。