常用菌种的保藏方法有哪些

 菌种，多是指国家指定的几个菌种保藏中心的成品菌种，在液氮状态下，盛放在安瓿管中。企业生产按国家要求，必须要国家指定的菌保中心购买菌种，不得采用外来菌种。

一、常用菌种保藏方法

1、菌种保藏原理

根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。

低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用，以提高保藏效果。

2、菌种保藏步骤

①挑选特征典型的纯菌菌落；

②确定保藏的合适菌体形态；

③选择最适宜的保藏方法；

④定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法，保藏期满应及时进行移种；

3、琼脂斜面低温保存法

（1）方法：

将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年——一年。有的甚至更长时间。

（2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。

（3）特点：

优点是——简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用；

缺点是——保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。

（4）注意事项：

保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。

保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。

每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。

保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于2 %为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。

铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。

4、液体石蜡保存法

本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期：

（1）方法

将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15mL，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~ 170℃烤箱中1 ~ 2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。

将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。

（2）适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。

（3）特点：本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，该法主要使菌种与空气隔绝。

（4）注意事项：

①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏；

②保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种；

③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用；

④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染；

⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1cm为宜；

⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。

二、菌种的复苏与保存

菌种的复苏与保存应在专用超净工作台或生物安全柜内进行。

1、菌种的复苏

把冻干菌种管、灭菌1mL滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入超净工作台或生物安全柜。

先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕，再将冻干菌种管外壁用dian酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。

取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24h。

取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3代即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。

2、菌种的传代与保存

方法1：菌斜面（保存）

培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌名及接种日期。

至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。

点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。

堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。

取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。

将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存，一般 3个月转种一次。

方法2：菌斜面-营养肉汤-分离平板-菌斜面

如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分离菌落）：用接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置营养肉汤中(5mL/支，已灭菌)，置35~37℃培养18~24小时后，再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液），接种于分离平板，置35~37℃培养18~24小时，用接种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面，置35~37℃培养18~24小时。一般同时接种几支管，其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种。

常用分离平板包括：大肠埃希菌——EMB琼脂平板；铜绿假单胞菌——溴化十六烷三甲铵琼脂培养基；金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基。

3、菌悬液的制备

取上述培养好的菌种斜面移入超净工作台或生物安全柜，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种置营养肉汤中(5mL/支，已灭菌), 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养18~24小时，取出备用。

一般于冰箱中保存可用7天。

4、对照用菌液制备

取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液1mL，加到9mL，0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL，0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-2……以此类推，稀释至含活菌数在50 ~ 100个。用平板计数。

此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在1天内使用。

5、菌种保管

菌种保管应有专人负责，保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。菌种应有详细登记本，包括名称、分离日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种3次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和变异，如，发现污染和变异时，应及时更换。购置菌种，应有介绍信。全部保存菌种应具备清单，并定期向部门负责人报告。