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Elisa样本测值低的原因

2020-10-29 9:59 来源:上海远慕生物试剂
ELISA 实验中,实验者经常会遇到样本测值低的问题,样本类型包括血清、 血浆、组织匀浆、细胞裂解液等。假设客户的操作完全正确,标准曲线良好, 这种情况样本测值低可从两方面进行分析:一是样本本身含量可被检测,但由 于实验操作等原因导致样本测值不在试剂盒检测范围内;二是分析物在样品中 本身浓度偏低。下面将从这两个方面来进行分析导致样本测值低的因素以及对 应的解决方案。

1.样本本身含量可以被检测,有哪些原因导致测值低呢?

1)试剂盒的保存

试剂盒要按照规定的方法保存,实验者在购买试剂盒时请务必留心试剂盒 不同组分的保存方法。如优尔生的试剂盒建议检测液 A、检测液 B、标准品以及 酶标条等储存在-20 度,而其它标准品稀释液等储存在 4 度。

2)样本上样前的准备

这个过程包括样本的制备、保存以及是否有经历过反复冻融。样本的制备 要根据样本类型采用不同的方法,血清、血浆与细胞裂解液的制备方法均不同。 保存,包括保存温度以及保存时间。一般推荐样本制备后进行分装后储存在-20 度或-80 度,储存时间不宜过久,因为长时间的储存有可能导致目标蛋白的降解, 致使检测结果不理想。最后注意不要反复冻融,蛋白样本反复冻融会导致降解发生。

3)稀释方案

样本的稀释对于实验的成功至关重要,稀释过度以及稀释不足均有可能导 致样本的测值低。

稀释过度:一般情况下客户都会根据文献测值,以及检测范围估计一个稀 释倍数,优尔生的试剂盒在出厂之前也会做大量检测,对于常规样本如血清血 浆,我们也会根据实验室样本测值情况推荐一个稀释倍数。但实验者如果直接 按照估计或推测的稀释倍数进行稀释检测后,发现样本 OD 非常低。这是由于文 献作者用的样本,优尔生实验用的样本与实验者的样本会存在一定的差异,这 些测值有一定的参考意义,但如果照搬,可能会导致实验失败。所以建议实验 者在正式试验前是先做预实验确定样本的有效性以及最佳稀释倍数。预实验, 可参考文献,将样本进行梯度稀释,最后选取样本 OD 落在标准曲线中间位置的 点的稀释倍数。

稀释倍数不够:钩状效应,Elisa 实验中发生钩状效应主要是当抗原与抗体 比例不合适而导致假阴性的现象,抗原过量称为后带效应。当样本中目标物含 量很高,而没有进行正确的稀释,就有可能会导致假阴性反应。解决方案依旧 同稀释过度的解决方案一样,在正式实验之前做预实验。

2.分析物在样品中本身浓度偏低

很多时候,客户操作没有问题,标准曲线良好,但检测多次样本依然不在 检测范围。像细胞因子,如 IL-6 需在炎症刺激情况才会大量产生,一般非炎症 样本测值会非常低。针对这种测值比较低的情况,一般建议根据文献选取适合 的样本类型,同时可以选用高灵敏度的试剂盒,优尔生针对某些容易出现测值 低的指标都有研发出高灵敏度的试剂盒,如 IL-6 等。

以上就是实验者在实验过程会遇到的样本测值低的部分原因,以及一些分 析以及解决方法。当然,具体问题还需具体分析。成功的 Elisa 实验依赖于质 量过硬的试剂盒,恰当处理的样本以及良好的操作技能。
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