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姐妹染色单体差别染色 @远慕实验

2020-07-31 9:49 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂
姐妹染色单体区分染色法 (Sister chromatid differentiation , SCD )是 70 年代中期发展起来的染色体处理技术。 Latt ( 1973 )在培养的细胞中加入 5- 溴脱氧尿嘧啶核苷( BrdU ),当用 Hoechst33258 荧光染料染色时,发现了姊妹染色单体的色差反映和它们之间互换的现象。

1974 年 KO Renberg 和 Froeed-Lender 改进了这一技术,建立了较简易的 BrdU-Giemsa 技术。这种技术用于研究细胞周期、染色体半保留复制、染色体的分子结构和畸变,以及 DNA 的复制、损伤与修复等一系列重要理论问题,还可以用于分析姊妹染色单体互换( Sister chromatid exchange, SCE )频率。

由于 SCE 能灵敏地检测染色体的变化,表现出剂量 - 效应关系。因此,目前已把 SCE 列为检测致突变物、致癌物地常规指标之一。

一、原理

5- 溴脱氧尿嘧啶核苷( 5-Bromodeoxy-urdine, BrdU )在 DNA 的复制过程中,掺入新合成的链并占有胸腺嘧啶( thymidine, T )的位置。根据 DNA 的半保留复制规律,哺乳动物或人的细胞在 BrdU 的培养液中经历了两个周期后,它的两条姊妹染色单体的 DNA 双链在化学组成上有了差别。

当染色体的 DNA 链的两条多核苷酸链都被 BrdU 所替换, Giemsa 染色显示浅色,如果染色体的 DNA 链中仅有一条多核苷酸链被 BrdU 所替换, Giemsa 染色显示深色。应用姊妹染色单体区分染色法( SCD )研究来自一个染色体的两条单体之间在同一个位点发生同源片段的交换,称为姊妹染色单体互换。

二、用品和试剂

45 ℃水浴,紫外线灯( 20W )。余同外周血染色体制备。

试剂: BrdU 溶液:用无菌青霉素瓶,在普通条件下称取 BrdU 2mg ,然后在无菌室内加入无菌生理盐水 4ml ,用黑纸避光, 4 ℃冰箱保存,新鲜配置。 1 × SSC 溶液: 0.15mol/L NaCl , 0.015mol/L 柠檬酸钠。

三、操作步骤

l .细胞培养:常规培养人外周血淋巴细胞, 24h 后,加入 BrdU 使其终浓度为 20 μ g/ml 。

2 .继续避光培养 48 小时,终止培养前 2 — 3 小时加秋水仙碱。

3 .培养结束收获细胞,常规制备染色体,操作同实验一。

4 .染色体制片在 37 ℃恒温箱内老化 24 小时或室温放置 1 — 2 天。

5 .将染色体制片的玻片正面向上平铺在恒温( 45 ℃)水浴锅上,在玻片上滴加已预热至 45 ℃的 1 × SSC 溶液。

6 .将紫外灯放在恒温水浴上,灯与标本垂直,其外加盖报纸数张以阻挡紫外线。照射距离为 6cm ,时间 15min 。

7 .照射完毕后以蒸馏水洗去 1 × SSC 。

8 . 1 ∶ 10 Giemsa 染色 5 分钟。

9 .自来水细流冲洗去多余染料,干燥,镜检。

10 .计数 SCE 。选择染色体分散较好,数目为 46 的中期分裂相 20 个进行观察计数,凡在染色单体端部出现的互换计为一次 SCE ,在染色单体中间出现的互换计为两次 SCE 。凡在着丝粒部位发生一次互换,判断不是两条染色单体在着丝粒部发生的扭转,计为一次 SCE ,但另列入“着丝粒区互换( CME )”一项。
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