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细胞因子生物学活性检测实验

2020-07-29 10:33 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂
白细胞介素1是一种重要的细胞因子,主要由单核-巨噬细胞产生,IL-1不仅对多种免疫活性细胞有重要的调节功能,而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。目前对IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。

一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性
 
小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体,在有IL-1同时存在的条件下,IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。根据加入IL-1后增殖水平(3H-TdR掺入率)的增加可计算出样品中IL-1的活性单位,或计算出刺激指数。

二、应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活性
 
小鼠胸腺瘤细胞系EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1受体,在IL-1诱导下产生高水平的IL-2,通过用IL-2依赖株CTLL-2检测IL-2的生物学活性,从而反映检测样品中IL-1的水平。

实验材料:
ConA EL4细胞 CTLL-2细胞
试剂、试剂盒     
FCS RPMI1640 3H-TdR PPO POPOP 二甲苯
仪器、耗材     
滤纸 收集仪 计数仪 96孔板 吸管 滴管 试管 加样器 CO2培养箱


实验步骤:

一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性

1.  取6~8 周龄C57BL16小鼠,拉颈处死,无菌取胸腺置不锈钢网筛上,用注射器针蕊研磨成细胞悬液调整细胞数为1.5×107 /ml

2.  细胞悬液内加入ConA,使终浓度为3 μg/ml,在96孔培养板中加100 μl(1.5×106细胞)

3.  加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品100 μl/孔(ConA终浓度为1.5 μg/ml),37 ℃  CO2孵箱 66 h

4.  每孔加3H-TdR 0.5 μci,37 ℃ CO2孵箱 6 h

5.  多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上

6.  烤干,移入液闪瓶中,加适量闪烁液,于液闪仪上测β计数

7.  计算

(1)从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位

(2)也可用刺激指数(SI)表示
 
实验组cpm
SI=────── ×100%
    对照组cpm

二、应用 EL-4 CTLL检测IL-1生物学活性
 
1.  用EL4细胞两步法检测IL-1活性

(1)收集处于对数生长期的EL4细胞

(2)洗涤后,用1 %FCS RPMI1640重悬细胞,并调整细胞浓度2×106 /ml

(3)加处96孔板中,100 μl/孔

(4)加入不同稀释度的IL-1α或IL-1β,100 μl/孔,同时设1 %FCS RPMI 1640对照

(5)5 %CO2 37 ℃培养18~24 小时

(6)按终稀释度为1∶10~20转入另一块96孔板中

(7)用CTLL-2 检测IL-2活性、检测方法见"IL-2检测"

2.  用EL4细胞一步法检测IL-1活性

(1)用5 %FCS RPMI 1640调整EL4细胞浓度至2×105 /ml,CTTL-2浓度至4×105 /ml

(2)加入96孔板中,两种细胞各加50 μl/孔

(3)加入不同稀释度的IL-1或待测样品,同时设EL4和CTLL-2细胞对照    

(4)置5 %CO2,37 ℃培养24~28 小时后加入3H-TdR,0.5 μci/50 μl/孔,继续培养6~8 小时

(5)收集样品,β计数

注意事项 :

一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性

1.  不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异,据国内资料报道以C57BL为好。
 
2.  不同周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应性不一,一般选用6~8 周龄,小于5 周或大于10 周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应不稳定。

3.  ConA促丝裂原作用要进行预试,一般采用亚适剂量。

二、应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活性

1.  在一步法检测IL-1时,其EL4细胞浓度不宜超过1×104 /孔,血清终浓度应<5%。

2.  在二步法检测IL-1时,其EL4细胞浓度在2×105 /孔时,转移上清稀释度不宜低于1∶8,其诱导时间应12~24 小时间为佳。诱导血清浓度应≤1%。

3.  在检测经诱导的上清中IL-1时,应避免使用A23187,TPA和ConA等较强的能诱导EL4细胞产生IL-2的诱导剂来刺激IL-1的产生。
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