原始菌种、菌液的制备及保存的标准操作规程

1目的
      菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。规范菌种原始菌液的制备及长期保存。
 
     2内容
     2.1定义
      原始菌液--由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液。
      工作菌液--由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。
     2.2 总则
       微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）。每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。
       经检查如果满意，贴上合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2 ～8℃）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记录以便能追踪传代史。
       生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。
       原始菌种的传代次数最多传至第五代。
     2.3 培养基
     2.4 冻干菌制备原始菌液
     2.4.1 由甘油冷冻菌制备原始菌液
     2.4.1.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。
     2.4.1.2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化；
     2.4.1.3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中；
     2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间；
     2.4.1.5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。
     2.4.2 由集菌平板制备原始菌液
     2.4.2.1 在超净工作台内，把经过24h（或更长时间）培养的菌液摇匀，各取1ml，无菌转移至5只培养基平板上，轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。不同培养基适用于不同菌种。
     2.4.2.2 另用一只平板，划线分离菌液，培养之，以检查菌液是否纯种。
     2.4.2.3 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。
     2.4.2.3.1 生长菌-24h以内即可显见增长；
     2.4.2.3.2 孢子-需要3～7天或更长时间才能得到50%孢子，这样可确保提到浓的悬浮液。对需长时间培养或培养温度较高（55℃）的平板进行适当密封，以免培养基失水干裂。
     2.4.2.3.3 分生孢子，一般需要5～14天才能获得明显的分生孢子生长物，将平板封口，以免分生孢子污染空气。
     2.4.2.4 在超净工作台内，各取约8.0ml氯化钠磷酸缓冲液（PBS）加至经培养后的集菌平板内。
     2.4.2.5用弯曲的接种棒（或无菌玻璃弯头）轻轻地刮平板表面，使菌落与平板分离。但注意不要划破培养基。倾斜平板，使菌悬液集中于平板一端，用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，把5只平板中的菌悬液收集于一只大小合适，便于封口的试管中。
     2.5 标记
     在原始菌液的标签上记述下列内容：
      2.5.1 菌种名称
      2.5.2原始菌种制备编号（代数+制备日期）
      2.5.3有效期（孢子悬浮液的有效期为一年）
      2.5.4操作者姓名
     菌液浓度一经标定后，即应补记在标签上。
      2.6 原始菌液的浓度标定
      2.6.1标定孢子初始制备液的浓度并进行记录，以后，每次使用该原始菌液时，不论直接使用或用其配制工作菌液，都应事先重新标定其浓度。前一次标定浓度仅供参考；
      2.6.2 除非有定量要求，一般生长态菌的原始菌液无需标定，生长菌很易死亡，因此不能保持稳定可靠的浓度。
      2.7 菌种的斜面保存
      2.7.1经常使用的菌种。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2℃～8℃的冰箱中保藏。
      2.7.2 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。
      2.8 菌液甘油冷冻管保存
      2.8.1将液体培养基培养或固体培养基培养制备的剩余原始菌液中加入足量的无菌甘油得到10%甘油液。轻轻振摇，使其充分混和；
      2.8.2 各取2.0ml上述混和液，无菌分装于10支冷冻用小试管或冷冻管中，在管子上注明菌种名称、菌种号等以及从冷冻日起2年的有效期。做好记录，并妥善保存。
      2.8.3 制备好的菌液甘油冷冻管在-80℃超低温或液氮罐内贮存。
      2.9 液体石蜡管的保藏
      2.9.1 将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。
      2.9.2 将菌种接种在新鲜琼脂斜面中，并在相应的适宜条件下培养（培养时间一般为24h）；
      2.9.3 在超净工作台下无菌操作，用无菌吸管吸取无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm，再将菌种管于2℃～8℃保藏。
      2.9.4 将试管直立，置低温或室温下保存。
      2.9.5 液体石蜡保藏菌种有效期为一年。
      2.10 注意事项
      2.10.1 每天应检查菌种保藏室或冰箱的温湿度状况，并用专用记录本记录；
      2.10.2 经常检查菌种管的塞子是否松动，如有异常应及时处理；
      2.10.3经多次传代的菌种，应定期检查其纯度及其变异性（与原始记录相比较），若有异常，应更换新菌种；
      2.10.4 带有实验菌的废弃物和超过有效期的菌种，121℃高压灭菌后按有关规定销毁，并认真填写"检定菌液使用、销毁记录表"。