反向PCR （inverse-PCR）实验步骤

inverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多，而Inverse-PCR一般只要有特异条带，基本上就是目的片段。

基本步骤如下：

1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。

a. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界（左边界、右边界均可）和酶切位点附近设计引物P1、P2；

b. 回收DNA，T4连接酶连接，使酶切后的DNA片段环化；

c. 回收连接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可扩增到两端为T-DNA插入序列，中间为侧翼序列的片段。

2、限制性内切酶消化：选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。

根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：

37度 过夜，电泳检测酶切效果。

3、回收DNA

① 将酶切产物转到1.5ml离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250μl；

② 加入等体积的酚和氯仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1min；

③ 最大速度（13, 000 rpm）离心1min；

④ 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置1min；

⑤ 最大速度（13, 000 rpm）离心2min；