干货分享：探讨 rRNA去除的方法与必要性

遗传中心法则表明，DNA是生物体内遗传信息的载体。遗传信息在精密的调控下从DNA转录成RNA，再传递到蛋白质。因此RNA被认为是DNA与蛋白质之间生物信息传递的“桥梁”，在研究转录组信息中占有着重大的作用。
背景介绍
转录组（transcriptome）是指在某一特定的生理条件下，细胞、组织或者生物体内所有的转录产物的集合，即转录出来的所有RNA总和，包括编码RNA（即mRNA）和ncRNA（tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等不同类型的RNA分子。在这之中核糖体RNA (rRNA) 约占RNA总量的 80%，是最多的一类RNA，通常这类RNA分子量比较大且代谢不活跃，种类包括：原核生物中5S rRNAs、16S rRNAs和23S rRNAs三种，真核生物中5S rRNAs、5.8S rRNAs、18S rRNAs和28S rRNAs四种。

图1：RNA分类图
rRNA的“作用”
随着人类基因组计划（HGP）和DNA元件百科全书计划（ENCODE）的完成，人们发现在人类基因组中大部分DNA都可以转录成RNA，但是仅有1.5%的核苷酸序列用于蛋白质的编码，剩余不编码蛋白质的的非编码RNA（ncRNA），被认为是基因组转录噪音。这种转录组噪音（无效信息）基本全部来源于丰度最高的成员——rRNA。


测序的目的就是为了更多的获得生物信息，但是rRNA这个在RNA中最丰富的成员却只能提供非常少的转录本的信息，且检测到过多的rRNA会掩盖其它基因的表达丰富度；因此，通常在测序之前从RNA样品中除去rRNA，rRNA去除的效率也被视为最大化读取到转录物的关键因素。

图2：人类组织或细胞总RNA中各种RNA分布饼状图
rRNA的“去除法”
目前rRNA去除的方法主要有两种，一种是通过DNA探针或者RNA探针杂交捕获rRNA再用磁珠吸附去除的方法，这种方法称为Ribo-Zero-seq；另一种是利用双链特异性核酸酶处理的方法提取mRNA，称为DSN-seq。两种方法对应的原理与区分如下所示：
方法一（DSN-seq）
去除流程：特异性探针（区分物种）与rRNAs杂交——RNase H消化rRNAs——DNase I消化探针——其他RNA富集纯化
市场占比：在市场现有品牌中占据绝大多数
优势：样本起始量要求低；rRNA残留量更低
缺点：其操作较复杂；暂无混合样本效果验证；
流程图：
方法二（Ribo-Zero-seq）
去除流程：生物素标记探针与rRNAs杂交——链霉亲和素磁珠去除探针与rRNAs——其他RNA富集纯化
市场占比：Illumina RiboZero与Thermo RiboMinus系列使用该方法
优势：磁珠法，操作简单；可应用于混合样本；
缺点：样本起始量要求高（一般为1 μg）；rRNA残留量相对方法1略高；
流程图：



rRNA的“高效去除”
Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)利用RNase H消化法去除人、小鼠、大鼠总RNA中的核糖体RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA去除效果。可用于高通量测序分析mRNA和非编码RNA，也可用于cDNA合成或其它下游应用。

图3：1μg 293T 总RNA 进行 rRNA 去除，利用 qPCR 对比去除前后 rRNA 基因和 mRNA 基因的Ct值变化（左图）
分别以1μg 人、小鼠、大鼠总RNA为样本，试剂盒去除rRNA后建库，测序获得rRNA残留%数据（右图）