大肠杆菌转化子有大有小原因分析

     本公司专业经销代理进口试剂，近日，我司实验室经常接到客户这样的疑问，他们在测试大肠杆菌转化子时，大肠杆菌转化子有大有小，结果诡异，想咨询一下具体原因。

     这情况我遇到过，尤其菌液PCR时候，有的强有的弱，有的带大小还不一样。我没有具体研究过啥愿意，但把大小一样的那个送去测序，一般都是正确的。

关于你的这个情况，我分析【我自己的我也分析过】
1、可能酶产物碎了一些，这样连进去就有大有小。如果你引物用的是在载体上的，那很可能扩出大小不同的。如果你引物就是在基因上的，这个好解决，你把退火温度逐渐提高，看看是不是那个不同片段就没了。
2、有的时候发生了片段自连【这个看起来好像很可笑，但其实我发现只要末端有一个碱基配对，时间长的话，片段是可以连接到一起的，这个就跟TA连接实际一样】。
3、你的电泳系统有污染，你把别人的片段给收进去了，这个我确实证实过，我一批克隆40个基因，我曾经在别的克隆中挑出过另外的基因。
4、另一种可能，你T载体上连接的方向问题，如果酶切不彻底，可能同样会造成不同大小片段，这些如果你量很多的话其实在跑电泳回收时候是分不开的，但PCR赶巧了，也许就正好扩出来了【这种情况只限于载体上有你用的酶切位点，而你目的片段上恰恰引入了这连个酶，这个你可以试着画个图看看，把TA连接的正反画画】。
5、DH好像能长很大的，也没关系的，我的有时候就很大点，其实不用放室温，你冰箱4-8℃那层放置1个月，就看出来了。
6、所以我觉得这个问题也没法纠结了。如果你觉得切割实在很难，那干脆重新PCR从T载体上扩出来【高保真扩一般也不会突变，当然TAKARA的primerstar除外】，带上酶切位点，然后直接回收酶切连接就可以了，找到重组子后测序正确在表达就行了不是。