欢迎来到上海远慕标准品对照品网官方网站!
021-58322859
18001933641

做了 5 年 MTT 实验,跟你分享几点心得体会

2019-05-23 14:19 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂

       做了 5 年的 MTT 实验 ,耗费了上万块 96 孔板。有成功的喜悦,有失败的沮丧,有好多话要对各位实验同仁说。在这之前,我们先回顾一下 MTT 的原理及操作步骤。

实验原理

       MTT 是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下,生成蓝色的 formazan 结晶。formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将 MTT 还原,无法形成结晶),且该结晶溶解于 DMSO。利用酶标仪测定波长 490 nm 处的光密度 OD 值,以反映出活细胞数目。

实验步骤

1. 接种细胞:用含 10% 胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔合适的细胞数量接种到 96 孔板,每孔体积 180 ul。

2. 培养细胞:同一般培养条件,可根据试验目的和要求决定培养时间。

3. 呈色:每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml 用 PBS 缓冲液 pH=7.4 配制)20 ul。继续孵育 4 小时,终止培养,小心弃去孔内培养上清液,对于悬浮细胞,需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO,振荡 10 分钟,使结晶物充分融解。

4. 比色:选择 490 nm 波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。

个人心得体会

1. 细胞消化、接种数量:注意消化和数量,消化和数量,消化和数量(重要的事情说三遍)。从我个人的实验经验来看,这是重中之重。

若消化出现问题,则会影响细胞的活性,进而影响 OD 值。对于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的细胞,消化时胰蛋白酶中不添加 EDTA,消化时也仅需胰酶浸润数秒即可。

然而,对于 SW480 等一系列难以消化的细胞,胰蛋白酶中需添加浓度为 0.25% 的 EDTA。对于细胞接种数量要适宜,过小或过大均会影响 OD 值(过小细胞容易死亡,过大细胞容易生长拥挤)。

我做过的几种常见细胞的每孔接种数量如下(个人经验):

2. 培养液的弃去及 DMSO 溶解:一般大家喜欢用移液器吸取孔内培养液,吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取,不要触碰底部的紫色结晶。我喜欢将 96 孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。两种方法效果差不多,大家根据个人喜好选择。

加入 DMSO 溶解后,我喜欢将加入 DMSO 的 96 孔板放入 37 ℃ 孵箱内孵育 10~20 min,这样有助于 DMSO 对紫色结晶物的溶解(尤其在冬天)。

以下是我在去年 12 月的一些结果(某种药物的细胞毒性实验,绿色为 control 组,红色为加药组)。下图结果显示,若不 37 ℃ 孵育,紫色结晶溶解不充分,造成 OD 值偏小(细胞毒性实验时,control 组的 OD 值zui佳范围为 0.5-0.7)。

加入 DMSO 后,37 ℃ 孵育 15 min,振荡 10 min。

 

无孵育,加入 DMSO 后振荡 10 min。

 

收缩
QQ咨询
  • 标准品
  • 对照品
  • 标准品网
  • 标准品厂家
电话咨询
  • 021-58993001
  • 021-58322859
  • 021-58999013
  • 021-58999639
邮箱咨询