人源化抗体转基因动物的研究进展与趋势

人源化抗体转基因动物是指利用基因 工程技术，将动物体内的免疫球蛋白基因 用人类的免疫球蛋白基因替换，从而使转 基因动物体内的人免疫球蛋白基因发生 重排和突变，直接表达产生人类的抗体蛋 白，利用转基因动物重排后的人抗体基因 序列或抗体蛋白，通过细胞工程和蛋白质 工程技术手段，制备出临床使用的人源化 抗体，用于重大疾病（如肿瘤）的治疗或 突发性生物安全事件（如SARS、EBOLA 等）的防控。截至2015年底，60余个来源 于转基因动物的人源化抗体进入临床试验 阶段，其中8个获得FDA批准进入市场应 用。人源化抗体转基因动物已成为抗体开 发的核心工具动物，对改善人民群众的健 康水平和保障公共卫生安全方面具有重要 的作用和意义。

1　人源化抗体转基因动物的发展历程 人源化抗体转基因动物的培育大致

可分为三个不同的发展阶段：代人 源化抗体转基因动物主要以能在动物体 内产生人类的抗体蛋白为标志；第二代 人源化抗体转基因动物增加了转入的人 免疫球蛋白基因片段，使人类抗体在动 物体内重排多样性得到进一步增加；第 三代人源化抗体转基因动物重点解决了 转入的人免疫球蛋白基因片段与动物B细 胞发育的匹配性问题，使得抗体的产量 和质量进一步提升。

1.1　代人源化抗体转基因动物

Brüggemann博士于1989年*早报道 人类免疫球蛋白基因能在动物体内进行 重排和表达，在技术上验证了培育转基 因动物生产人类抗体的可行性1 。随后， Lonberg小组和Green小组在1994年分别成 功培育出了人源化抗体转基因小鼠，使 培育人源化抗体转基因动物生产人类抗 体蛋白成为现实2 3 。

早期的人源化抗体转基因动物直接 将人的免疫球蛋白基因转入动物体内， 使其重排产生人类抗体蛋白。但由于动 物会优先使用自身的免疫球蛋白基因， 因此转入的人免疫球蛋白基因的重排和 表达受内源性免疫球蛋白基因影响较 大，为克服这一问题，培育的代人 源化抗体转基因动物是在转入人免疫球 蛋白基因的同时，对动物内源性免疫球 蛋白基因（重链、к轻链和λ轻链）进行 失活4 。

1.2　第二代人源化抗体转基因动物

人免疫球蛋白重链（hIgH）基因约 有1250kb，人免疫球蛋白к轻链（hIgκ） 基因约1820kb，人免疫球蛋白λ轻链 （hIgλ）基因约900kb。要在体外获得如 此长的基因片段并将其完整导入到动物 体内、实现稳定遗传具有较高的技术难 度。500kb的基因片段是体外基因操作的 极限5 ，因此，代人源化抗体转基因 动物中的人免疫球蛋白基因已进行了改 造，一般转入500kb以下的免疫球蛋白基 因片段，尽管能够获得人类抗体蛋白， 但受转入基因片段调控区的限制，其重 排多样性受到制约。

第二代人源化抗体转基因动物是在 代基础上，重点解决免疫球蛋白超 大基因的稳定转基因、增加人类抗体重排 多样性的问题。第二代人源化抗体转基 因动物利用胚胎干细胞和基因同源重组技 术，采用多次介导小片段基因转入和体内 同源重组技术实现了完整的人免疫球蛋白 基因稳定转入，使抗体重排多样性得到保 障。但这一技术目前已有保护，进行 商业化开发需要获得许可。

1.3　第三代人源化抗体转基因动物

免疫球蛋白除了能够重排表达形成 抗体外，在B细胞的发育过程中也扮演 重要的角色。B细胞发育早期阶段所需 的B细胞受体（B cell receptor，BCR） 由免疫球蛋白重链与信号蛋白Igα和Igβ 分子组成。在人源化抗体转基因动物 中，BCR中人的免疫球蛋白重链与动物 自身信号蛋白的Igα和Igβ的相互匹配性 并不是*优的，因此对B细胞的早期发 育、B细胞分化抗体类型转换、亲和力成 熟都具有重要的影响6 。

为解决以上问题，VelocImmune和 Kymab人源化抗体转基因小鼠仅将小鼠 免疫球蛋白的V区、D区和J区全部替换为 人免疫球蛋白V区、D区和J区，解决早期 B细胞发育的问题，抗体的表达量和亲和力得到进一步的改进，但其产生抗体为 人鼠嵌合抗体，需要二次改造才能形成 全人源化抗体6 7 。2016年，重庆市畜牧 科学院成功培育出中国的人源化抗体转 基因小鼠（CAMouse），其采用时空特异 性表达技术，在B细胞发育的早期阶段， 免疫球蛋白重排形成鼠源BCR，解决B细 胞发育的匹配性问题，而在B细胞发育到 浆细胞阶段，免疫球蛋白重排直接表达 形成人类抗体蛋白，这样转基因小鼠B细 胞的早期发育、B细胞分化抗体类型转 换、亲和力正常。

2　主要人源化抗体转基因动物品系

由于人源化抗体转基因动物培育难度 较大，截至2015年底，全球仅有少数几家 单位成功培育出能生产全人源化抗体的转 基因动物，其他抗体研发公司基本上都是 与以上单位进行合作利用转基因动物研制 人源化抗体。此外，Therapeutic Human Polyclonals Inc（THP）、Ablynx、Origen Therapeutics、Revivicor等公司目前也在利 用兔、骆驼、鸡和猪开展人源化抗体转基 因动物的研究，但尚在进行之中，因此本 小节仅介绍已培育成功的世界主流人源化 抗体转基因动物8 9 。

2.1　XenoMouse 小鼠

XenoMouse小鼠是由Cell Genesys公 司的Green博士领衔培育出的代人源 化抗体转基因小鼠。早期的XenoMouse 转入的人免疫球蛋白基因片段仅含有5个 重链V区和2个к轻链V区，后经优化升 级，目前XenoMouse携带有人IgH和Igк的 主要基因序列，其中人IgH约1.0Mb（含 有34个V区，23个D区，6个J区，以及 Cμ、Cδ），人Igк约0.8Mb（包括32个V 区，完整的J区，C区，KDE，Igк intronic 和3’增强子），而小鼠自身的IgH和Igк已 被失活。该品系小鼠可以识别人类的蛋 白作为抗原，产生体液免疫反应。利用 XenoMouse小鼠，从体内免疫到利用杂交 瘤技术筛选出人源化抗体，只需3个月的 时间，筛选出的抗体亲和力可达pM10。1996 年，Cell Genesys公司将XenoMouse小鼠 业务分拆出来成立Abgenix公司，2005 年，Amgen公司花费22亿美元，收购Abgenix 公司11。

2.2　UltiMab 小鼠

UltiMab小鼠与XenoMouse小鼠同步 出现，由美国Medarex公司Lonberg博士 领衔培育而成。UltiMab小鼠与XenoMouse 小鼠性质类似，转入了人IgH和 Igк的主要基因，同时使小鼠自身的IgH和 Igк失活，差异在于UltiMAb小鼠采用原 核注射的方式培养，而XenoMouse采用酵 母原生质融合的方式培育而成2 。Ulti- MAb小鼠经过几代的发展，已由*初的3 个重链V区、4个к轻链V区发展成能产生 所有抗体亚型的人源化抗体转基因小 鼠，并开发了30余个抗体药物进入临床试验4 。2009年，百时美施贵宝支付 24亿美元收购Medarex公司12。

2.3　Harbour 小鼠

Harbour公司目前拥有H2L2和 HCAB两个品系的小鼠。H2L2小鼠内 源性的抗体表达被失活，同时转入了 嵌合的人/大鼠/小鼠的免疫球蛋白基 因。其转入的免疫球蛋白重链基因包 括18个人的V区，19个人的D区，6个 人的J区，大鼠的C区及小鼠的LCR 区，转入的免疫球蛋白к轻链包括11 个人的V区，5个人的J区，1个大鼠的 C区，同时在大鼠C区的两侧各有1个 小鼠的增强子。其产生的抗体亲和力 可达（p～n）Molar。HCAB品系为单 链特异性抗体转基因小鼠，小鼠自身 的重链C区和к轻链被敲除，转入的人 免疫球蛋白重链基因部分包括8个人 V3区，1个人V6区，人AIID区和6个 人的J区，同时还带有小鼠Cγ和小鼠 LCR区。该品系小鼠可用于双功能抗 体和四价抗体的开发13。

2.4　OmniAb

OmniAb目前拥有3个不同品系的 人源化抗体转基因动物，即Omni- Rat、OmniMouse以及OmniFlic，由英 国Marianne Brüggemann博士主导培育 而成。OmniRat携带有嵌合的人／大 鼠免疫球蛋白重链基因（包括22个人 V区，所有的人D区和J区，以及大鼠 的C区）和人的免疫球蛋白轻链（12 个人к轻链V区和Jk-Ck，16个人λ轻链 V区和Jλ-Cλ），同时利用锌指核酸酶 对大鼠内源性免疫球蛋白基因进行灭 活。OmniRat具有正常大鼠相近的免 疫功能，免疫1只OmniRat，通过杂交 瘤技术可获得约1600个克隆，其中阳 性克隆为148个（正常SD大鼠约可获 得3520个克隆）。 OmniMouse小鼠培 养方式与OmniRat类似，但其携带的 人免疫球蛋白V区要多于OmniRat。 OmniFlic是用于单链抗体开发的人源 化抗体转基因大鼠，与OmniRat相 比，仅在人免疫球蛋白轻链方面存在 差异，OmniFlic仅携带有重排后的单 个Vk-Jk-Ck，其可避开杂交瘤技术获 得抗体基因的相关信息14。2013年， 药明康德宣布引入OmniRat开展人源 化抗体合作研究15。

2.5　VelocImmune 小鼠

VelocImmune小鼠是美国Regeneron 公司培育的人源化抗体转基因小 鼠，其将小鼠IgH和Igк的V区精确地 替换为对应的人IgH和Igк的V区，保 留了小鼠自身的所有C区及其他基因 表达调控元件。通过连续三次同源重 组，VelocImmune小鼠*终携带了人 IgH的80个V区和Igк的40个V区。该小 鼠具有正常小鼠类似的免疫反应特性 和抗体产量，已开发了10余种抗体进 入临床试验阶段，但该小鼠存在的问 题是产生的抗体是人鼠嵌合抗体，需 要进行二次改造才能实现全人源化7 。

2.6　Kymab 小鼠

Kymab小鼠由英国Kymab公司和 Sanger研究所共同培育而成，其构建 策略与VelocImmune小鼠类似，也是将 小鼠IgH和Igк的V区精确地替换为对应 的人IgH和Igк的V区，保留了小鼠自身 的所有C区及其他基因表达调控元 件6 。细微的差别是VelocImmune小鼠 采用的经典的同源重组策略实现完整 的V区替换，而Kymab是采用的Cre介 导的同源重组技术实现完整的V区替 换，双方的冲突较大，2016年 10月，英国Kymab公司宣布与中国岸 迈生物科技有限公司进行技术互相授 权及合作16 。

2.7　CAMAB 小鼠

CAMAB小鼠由中国重庆市畜牧 科学院培育而成，包括两类抗体小 鼠：CAMouseHG生产全人源抗体， CAMouseH生产全人源单域抗体（全 人源纳米抗体）。CAMouse小鼠携带 有经改造的人免疫球蛋白重链、人免 疫球蛋白к轻链和λ轻链基因，同时对 小鼠内源性免疫球蛋白基因进行了灭 活。CAMouseHG 和CAMouseH的 特点是具有人/小鼠免疫球蛋白时空 转换表达特性，在B细胞发育的早期 阶段，形成鼠源BCR结构，确保小鼠 B细胞的正常发育，在B细胞发育至 浆细胞阶段，则又利用人源的Gamma 区进行重排和表达，生产人源IgG。 CAMouse小鼠的B细胞发育正常，抗 体表达量高，重排多样性丰富，根据 目标抗体的需要，可以选择使用抗体 小鼠。

3　人源化抗体转基因动物的应用

2006年，利用XenoMouse开发的 panitumumab获得美国FDA批准进入 临床使用，这是个获批的来源于 转基因动物的人源化抗体，截至2015 年底，共有8个来源于转基因动物的 人源化抗体获得FDA批准（表1）， 适应证主要以肿瘤和自身免疫疾病治 疗为主， 包括明星抗体P D - 1 与 CTLA-4抗体，均由转基因动物开发 而来，目前来源于转基因动物的抗 体全球年销售额已超过30亿美元。 自1996年以来，共有130余个人源化 抗体进入临床试验，其中利用人源 化抗体转基因动物共开发了60余种 治疗性抗体，约占全部人源化抗体 的一半，已有21个完成临床试验， 22个在进行临床试验（7个Ⅰ期，14 个Ⅱ期，1个Ⅲ期）。根据统计，来 源于转基因动物的全人源化抗体从 Ⅱ期到Ⅲ期以及从Ⅲ期到获得FDA 许可的比例要高于其他方法制备的 人源化抗体17。

4　人源化抗体转基因动物 未来发展展望

随着基因编辑技术的快速发展， 未来将会在越来越多的物种上培育出 人源化抗体转基因动物，其功能特性 也将日趋完善，但相关保护则是 在培育人源化抗体转基因动物初期就 需要优先考虑的问题。在相当长的一 段时间内，人源化抗体转基因动物仍 将是人源化抗体开发的一项核心技 术，而人源化抗体转基因大动物和单 链抗体转基因动物将是对现有人源化 抗体转基因动物的重要补充18。 人源化抗体转基因大动物在短期 内可以大量产生特异性抗体，在公共 安全事件防控方面具有重要的作用。 尽管日本Kyowa Hakko Kirin公司已培 育出全人源化转基因牛，但由于其采 用的技术存在一定的缺陷，难以稳定 遗传，目前尚无法正常使用，需要进 一步完善19。在培育大型转基因动物 时，除了通用技术外，还需要考虑其 繁殖性能、生物净化难易程度等特 性。综合考虑，利用猪和兔等大型 或高繁殖性能的动物将是未来的重 要补充。

来源于驼科的单链抗体转基因 动物由于分子量小，穿透力强，能够 通过常规抗体无法到达的部位，具有 重要的医药价值，已受到广泛的关 注。目前，已有多家单位开展单链抗 体转基因动物的培养，相信这一领域 近期内会取得越来越多的进展。