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献给初学者:如何在细胞中稳定表达基因

2019-03-12 13:20 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂
作为细胞生物学专业的博士生,在基因功能研究上已经有五年的经验了,今天我给大家讲讲其中经常用到并且非常重要的一种技术--慢病毒包装的过表达体系。下面我就从引物设计,慢病毒表达质粒构建等方面详细讲述。

下面以 plex-MCS 载体为例。

1. 选择酶切位点,为了避免移码突变,上游的酶切位点选择起始密码子 ATG 前面的 spel,下游选择 xho1。
2. 构建方法的选择。


连接法
对于连接法,首先设计引物将目的基因 PCR 出来,即酶切位点加基因引物,此时应注意,为了防止酶切将基因破坏,通常习惯在两端加入保护碱基。
尽量选择分数较高的保护碱基。
以 PKM2 基因为例,设计引物,首先查找它的序列
选择目的基因的种属来源。
选择目的基因的亚型。
查找到目的基因的 CDS 序列,以 FASTA 格式导出。
那么 PKM2 上下游引物分别为:
设计好引物后,通过 PCR 方法扩增目的基因,随后胶回收,同样使用 spe1 和 xho1 进行双酶切,回收后产物与载体酶切回收产物连接即可。


重组法
对于重组法,首先设计引物将目的基因 PCR 出来,即同源臂加基因引物,此时应注意,同源臂应包含酶切位点,同样以 PKM2 基因为例。其上下游引物分别为:
设计好引物后,通过 PCR 方法扩增目的基因,胶回收后的产物与载体酶切回收产物重组即可。
3. 转化,涂板,挑单克隆,测序。
4. 质粒构建成功后即可转染观察是否能在细胞中表达。
以上就是通过慢病毒包装体系在细胞中过表达基因的方法,此外还应注意几点:
1. 在构建质粒时,zui好可以加入 GFP 标签,这样可以通过荧光的方法观察基因的表达情况,同时也有利于稳定筛选。
如果过表达效率不高时,可以通过流式细胞术进行筛选,获得带 GFP 的阳性细胞,使之纯度变高。
2. 在传代的过程中,由于细胞不断分裂,过表达的效果会不断减弱,所以如果需要更高纯度的阳性细胞,需要挑单细胞.

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