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使用二抗的直接法与间接法的优缺点!!!

2018-12-25 10:13 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂
随着蛋白组学的深入研究,多因子检测的需求日趋增加。但很多科研人员在选择多种标记的抗体时遇到困难,发现很多时候从市面上购买不到所需的标记好的商业化一抗,而不得不选择使用二抗。因此也很难避免可能发生的交叉反应、非特异性结合以及繁琐的孵育洗涤步骤。下面比较下直接法与间接法的优缺点。


 
方法 优点 缺点
直接法

操作简单,结果可靠;

仅需使用一抗,检测快速;

无二抗的非特异性结合。

仅需使用一抗,检测快速;

无二抗的非特异性结合。

由于标记可能导致一抗的免疫反应性降低;

信号放大作用较弱。

间接法 一抗含有多个标记二抗可结合的表位,因而灵敏度升高,信号放大作用较强。

二抗可能发生非特异性结合;

孵育及洗涤步骤增多。

 
表 1. 直接法与间接法的比较 直接检测法中,标记物通过共价键直接连接到一抗上。而对于间接检测法,标记物则是共价连接到与一抗特异性结合的二抗上。间接法检测包括两步:第一步,用未标记的一抗进行孵育,抗体与抗原结合(若存在抗原),洗去未结合的抗体(一般 3~5 次),第二步则是加入标记二抗孵育(通常 1 小时),洗涤去掉未结合的二抗,然后量化结合在一抗上的标记物。在直接法中,标记物直接与一抗共价结合,因此仅需与含有抗原的样本孵育这一步骤,而且只需一次洗涤,而间接法则需要两轮孵育与洗涤步骤。直接法简化了试验的流程,降低了试验的变异性,增加了数据的可靠性。然而一抗的共价修饰可以导致抗体亲和力的改变,这种情况的出现与标记二抗带来的非特异性结合的问题相比而言,显得无关紧要。下表列举出了直接法与间接法的主要优缺点比较。
 
图片 2.png
 
图 1. 间接法与直接法流式染色比较。CD45RC 纯化抗体商业化购得,然后用 Lightning-LinkTM R-PE 抗体标记试剂盒按流程进行标记。图中左下方流式染色结果为所购 CD45RC 纯化抗体孵育细胞,然后用 R-PE 标记二抗孵育上机检测,图中右下方流式染色结果为用 Lightning-LinkTM R-PE 标记的 CD45RC 抗体, 直接孵育细胞,上机检测。图中示意图说明:CD45RC 抗原用红色显示、 CD45RC 抗体用蓝色显示、二抗灰色显示。


 
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