检测抗原特异性 T 细胞的金标准---MHC 四聚体检测技术

       MHC 四聚体（MHC Tetramer）是一类免疫学试剂，由四个主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）与抗原肽结合的单体分子组成，并标记有荧光，用于 T 细胞免疫分析的 MHC 四聚体检测（MHC Tetramer Assay，或称 MHC Tetramer Stain）。

检测原理 & 应用领域

        MHC 四聚体检测技术于 1996 年由美国斯坦福大学医学院的 John D. Altman 博士所开发， 它在单细胞水平上标记目标 T 细胞，并通过流式细胞术对细胞进行分析，从而成为一种快速、简便的检测抗原特异性 T 细胞（antigen-specific T cells）的定性及定量分析方法。与其他应用于 T 细胞检测的方法如胞内细胞因子染色法（ICS）、酶联免疫斑点检测法（ELISPOT）等相比， MHC 四聚体技术具有高灵敏度、高特异性、定量分析简便且重复性高等优点，在肿瘤、感染、自身免疫性疾病等研究领域被越来越多地运用于：

细胞分选——特异性 T 细胞高效分选

抗原表位研究——抗原表位短肽亲和力筛选

病毒逃逸研究——病毒逃避免疫机制研究

细胞治疗研究——T 细胞表面受体 TCR 亲和力研究u 抗体筛选研究——「T-Cell Receptor-Like Antibodies」筛选研究uMHC 免疫功能研究——利用混合抗原表位片段鉴定 MHC 免疫功能

HelixGenTM MHC 四聚体试剂染色步骤

 HelixGen TM MHC 四聚体产品，能快速、简便地实现对抗原特异性 T 细胞（Antigen-specific T cells）的定性与定量分析。

（一）所需主要试剂和设备

1）欲检测的细胞或全血；

2）荧光染料标记 Anti-CD8 抗体或其它抗体；

3）离心机、流式细胞分选仪等。

（二）基本操作流程

细胞准备

1. 外周血单核细胞、脾细胞、淋巴细胞、常规细胞系细胞等，以 2-5×107/ml 的密度重悬于 FACS Buffer（PBS+ 2% 小牛血清+0.1% 叠氮钠；建议使用时新鲜配制），制备成细胞悬浮液。

2. 取 25ul 细胞悬浮液滴加入微孔培养板或 FACS 试管。

Staining Cocktail 制备

3. 制备 2X Staining Cocktail：FACS Buffer+ MHC 四聚体（建议稀释比例为 1:50～1:100）+ Anti-CD8/FITC 抗体或其他用作内参的抗体（请参考其说明书进行稀释）。

染色孵育

4. 取 25ul 2X Staining Cocktail，滴加入步骤 2 中的微孔培养板或 FACS 试管，与细胞悬浮液混匀。（注意：使用移液器轻柔上下吹打混匀，尽可能避免产生气泡。）

5. 在冰上或其他已通过实验优化确认的最佳温度条件下，避光孵育 60 分钟。

洗涤

6. 加入 150ul FACS Buffer 至微孔培养板每孔或 2-3 ml FACS Buffer 至 FACS 试管，轻柔混匀，避免形成气泡，1200 rpm 离心 5 min，小心除去上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。（注意：对于具有传染性或危害性的样本，可考虑使用吸引器，轻柔吸掉上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。）

7. 重复步骤 6，再洗涤 2 次。

细胞固定 & 流式分析

8. 将细胞重悬于 200 ul 固定液（PBS+1% 多聚甲醛（PFA））中，使用流式细胞仪进行样本分析。