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免疫组化正确姿势中的四个细节!!

2018-10-29 14:04 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂

董太师门下的弟子最近耗费大量元神得了一批老鼠,又跑去他族求得一批圣物——人类标本,本以为离飞升上仙仅一步之遥,却在忙活了数天、耗费了三魂三魄,在 DAB 显色液滴在载玻片上的 N 刹那后,听到了自四海八荒传来的轰轰天雷——切片上的腊肉竟然毫无反应!

弟子此次的天劫惊到了正在闭关的董太师,他放下正在研读的他山典籍《CNS》,走出山洞,细细端详了一番,缓缓说道:「你只学到了这门功夫的『形』,但『神』还缺些火候,现下,为师将把组化大法中需要提升的四个细节一一滴渡给你:

免疫组化正确姿势中的四个细节

1. 标本固定——不仅仅是「切一切」和「泡一泡」

温柔地取材:大刀阔斧取材的同时,视组织如珍宝,莫挤压组织,轻柔取材和镊取。尽量避开坏死区域。太大太厚的组织不利于均匀一致的固定,实质组织取材厚度应小于 5 mm。

新鲜的固定液: 固定液 10% 中性缓冲福尔马林 (NBF) 需新鲜配置,商用型固定液注意其标注的有效期,避免使用过期变质的固定液。

充分及时地固定:固定液要充足,其与组织的体积比最好大于等于 20 倍;取材后即刻固定。固定时需将瓶口封住,避免甲醛挥发。组织的固定时间不宜过长,一般过夜(12~24 h)即可。

2. 修复大法——不仅仅是「煮一煮」

微波炉修复:简单易行效果好,CST 推荐使用微波炉完成修复。

合适的修复液:根据抗体说明书使用合适的修复液。用柠檬酸修复后,切片需浸泡在修复液中,自然冷却;而用 EDTA 修复后,切片可直接从修复缸中取出,直接进行下一步。

注:使用不同的修复方式和不同生产商的抗体检测人肺癌组织中 EGFR 的表达。第一排为 CST 的 EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb(#4267),EDTA 的修复方式明显优于柠檬酸盐及胃蛋白酶,故在该抗体说明书中,标注了使用 EDTA 修复进行免疫组化实验。

3. 对的抗体,对的使用——不仅仅是「买买买和加加加」种属和应用范围:确定该抗体可检测所需种属(Reactivity)的石蜡切片上完成组化实验(Application: IHC-P)。

稀释液和稀释比:查看抗体说明书,使用正确的一抗稀释液和稀释比。

注:与#4060 在 TBST/5% NGS 中稀释后所得的信号强度相比,经 SignalStain® 抗体稀释液稀释后的信号强度更强;而对于#4407,选择 TBST/5% NGS 作为抗体稀释液的效果更好。

4. 匹配的二抗和显色系统——「配一配和滴一滴」

使用多聚 HRP(Poly-HRP)的二抗,即在二抗上连接大量 HRP,以充分放大信号;同时,配合优质的色原产品,提升灵敏度,增强信号。

注:在人肺癌标本中使用 Sox2(D6D9) XP® RabbitmAb#3579 检测 Sox2 的表达,使用基于多聚-HRP 的 SignalStain® BoostIHCDetectionReagent 的检测灵敏度更高。

注:DAB 色原比较:在人乳腺癌组织中使用 p-Stat3(Tyr705)(D3A7)XP® Rabbit mAb#9145 检测 p-Stat3 的表达,使用不同的产品进行显色。与竞争者的 DAB 产生的信号相比,SignalStain® DABSubstrateKit 的显色强度更佳。

CST 对实验细节进行了步步优化,抗体说明书也是为实验成功保驾护航的必备指南:

注:使用 PLK1(208 G4)Rabbit mAb #4513 检测人结肠肿瘤中 PLK1 的表达,在经过辅助试剂的步步优化后发现,使用一抗稀释液#8112 稀释抗体,聚合物型二抗#8114 进行检测,DAB 显色试剂#8059 后,可以检出 PLK1 的阳性表达。

编后记

免疫组化的实验步骤虽然较为简单,但是贵在精通,重在认真,要在细节,不忘 Protocol,方得 Result。

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