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我的石蜡切片又「团灭」了!没关系,专业技术人员与您并肩推塔!

2018-10-29 13:57 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂
最近,接到前线战报,上海生科院 320 大院的马同学正在使用 CST 的 PD-L2 抗体(#82723)在多种人组织上进行免疫组化实验。然而,多次实验均无法得到结果,切片上的细胞「团灭」而归。CST 技术人员闻悉后,决定进行实地探访,与科研人员一起,找到问题所在。

前期准备

在经过前期与马同学的讨论后,决定在这次测试中,对原 protocol 进行如下重大调整:

1. 测试时增加阳性/阴性对照片(Control slides:SignalSlide® PD-L1 IHC Controls #13747),确保抗体和染色结果的特异性;

2. 将高压修复法调整为微波修复法;

3. 使用 CST 的 EDTA 修复液;根据 CST 的 protocol,增加修复液的用量(适用组化修复缸,用量为200 mL/次),且修复后不冷却切片;

4. 使用全套 CST 辅助试剂,即 ImmunohistochemistryApplication Solutions Kit (Rabbit) #13079,确保体系的稳定性。

(左) CST技术人员与马同学共同讨论实验。(右)本次实验使用的修复缸

实验步骤

脱蜡与水化

1. 二甲苯脱蜡:3 × 5 min。(为确保测试时二甲苯新鲜,使用新的二甲苯)

2. 乙醇水化:100% 乙醇2 × 10 min;95% 乙醇,2 × 10 min。

3. 洗涤:切片浸没于ddH2O中,3 ×5 min。

抗原修复

4. 修复:使用200 mL ddH2O稀释后的SignalStain® EDTA Unmasking Solution#14747进行修复,根据实验室微波炉的实际情况,高火档加热2 min45sec后煮沸,立即换保温档,保温15 min。修复后切片不冷却,直接进行下一步。

5. 洗涤:切片浸没于dH2O中,3 ×5 min。

去除内源性过氧化物酶

6. 3% 过氧化氢处理切片,加盖室温放置15 min。(加盖的目的是为了防止过氧化氢与空气接触后并不稳定)

7. 洗涤:切片浸没于dH2O中,2 ×5 min。

8. 缓冲液转换:切片浸没于TBST中,1 ×5 min。

封闭与一抗孵育

9. 配置封闭液(Animal-Free Blocking Solution #15019),滴加在切片上,室温静置1 h。(此步建议一张张完成,防止干片)

10. 配置一抗:使用SignalStain® Antibody Diluent #8112 稀释PD-L2抗体(#82723)稀释度为1:200。

11. 横沥封闭液,用卫生纸尽量吸干封闭液后,将一抗滴加在切片上。(此步建议一张张完成,防止干片)

12. 将湿盒小心移入4度冰箱,过夜。

CST技术人员正在配置和滴加抗体

二抗孵育与显色

13. 小心取出湿盒,在室温平衡45分钟左右。

14. 洗涤:切片浸没于TBST中,3 ×5 min。

15. 将二抗SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit)#8114 滴加于切片上,室温孵育40 min。

16. 洗涤:切片浸没于TBST中,3 ×5 min。

17. 配置显色液:将一滴SignalStain® DAB Chromogen Concentrate(约30ul)加入1 mL SignalStain® DAB Diluent中,混匀。

18. 将显色液滴加于切片上,于显微镜(10倍目镜)下观察染色情况,待看到棕黄色阳性沉积,且背景不深时,将切片浸没于ddH2O中,终止染色。

19. 按实验室常规步骤复染核、封片。

测试结果

使用PD-L2的阳性对照切片SignalSlide® PD-L1 IHC Controls #13747,在阳性细胞团中见到阳性染色,在阴性细胞团中未见染色,提示抗体适用于石蜡切片,且特异性佳。

使用PD-L2(D7U8CTM ) XP® RabbitmAb( #82723)在对照切片SignalSlide® PD-L1 IHC Controls(#13747)上的HDLM-2阳性细胞团(左)和PC-3阴性细胞团(右)进行免疫组化染色

在马同学的人淋巴结石蜡切片上,也观察到了阳性染色。

使用 PD-L2(D7U8CTM) XP® RabbitmAb( #82723)在客户提供的人淋巴结石蜡切片上进行免疫组化染色

编后记

科研实验向来不是「躺赢局」,必须是「尽力局」:Victory 固然好,Defeat 也不用气馁,分析战后数据,调整实验方案和策略,下一次「匹配」开始后又是一场全新的战斗。

 
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