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远慕手把手教您细菌总蛋白和膜蛋白提取方法!!

2018-10-24 17:03 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂
       细菌蛋白是以碳氢化合物(如天然气或沥青)或甲醇作为底物,它们的蛋白质含量占干重的3 /4 以上,必需氨基酸的组成中同样缺乏含硫氨基酸,另外,它们所含的脂肪酸也多为饱和脂肪酸。用来生产细菌蛋白的主要有杆菌属(Bacilus) 和丝菌属(Nocardia )、微球菌属(Microcus) 和假单胞菌属(Pseudomonas ),并已经有工业化生产的先例。生产细菌蛋白的菌种主要以光合细菌为主,包括似真细菌的红螺细菌、绿硫细菌、着色细菌及似藻的蓝细菌。

 

一、从新鲜样品中提取总蛋白(简易法)

1、自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,调pH值至8.5-9.0备用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

2、将40ml 菌液在12000g,4℃下离心15分钟收集菌体,沉淀用PBS悬浮洗涤2遍,沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎,采用300w,10s超声/10s间隔,超声20min,反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片,上清可直接变性后PAGE电泳检测,或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点:Western blotting结果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白

1、Trizol溶解的样品研磨破碎后,加氯仿分层,2-8℃下10000g离心15min,上层水相用于RNA提取,体积约为总体积的60%。

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3min,2-8℃不超过2000g离心5min。

3、将上清移至新的EP管中,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇,室温放置10min,2-8℃下12000g离心10min,弃上清。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液,室温放置20min, 2-8℃下7500g离心5min,弃上清,重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇,涡旋后室温放置20min,2-8℃下7500g离心5min,弃上清。

5、冷冻干燥5-10min,1%SDS溶液溶解,反复吹打,50℃温浴使其完全溶解,2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。

6、替代方案:将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次,1000g离心10min去除沉淀,上清可直接用于蛋白实验。

三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污剂法)

1、配制疏水性蛋白提取液(非裂解液):1% Triton X-114,150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,调pH值至8.0备用。

2、菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体;用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗涤3次,最后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。

3、菌体沉淀加入1ml冷提取液,于4℃条件下放置2h,17000g离心10min,去除沉淀取上清。

4、将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性,37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。

5、将液相和去污相分开,分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45min。

6、于4℃条件下17000g离心30min,用去离子水洗涤沉淀3次。

7、将沉淀溶解在1% SDS溶液中,测定蛋白浓度,比较液相和去污相中蛋白提取效率,一般是去污相中疏水性膜蛋白较多,适于进一步蛋白实验。

8、SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。

 

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