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旧瓶装新酒:核酸纯化最近有哪些新亮点?

2018-09-25 13:12 作者:洛辰 来源:上海远慕生物试剂

在临床或科研实验室中,各种各样的样本在等待着核酸提取,包括常规的血液和细胞,新鲜、冷冻或陈旧的组织活检样本,以及环境或农业应用中的土壤或植物样本。提取是否成功,是决定下游实验能否顺利开展的关键。尽管核酸提取的方法已经成熟,但科学界还是有一些新亮点。

手动提取

手动提取核酸的方法主要分为两大类:液相提取和固相提取。尽管固相提取已经成为主流,但基于酚/氯仿的液相提取方法仍被广泛使用,也是当前研究和改进工作的主题。

2018年发表的论文《Optimization of phenol/chloroform RNA extraction》对经典的1987配方进行了改进1。它通过增加一次氯仿洗涤、几次RNA洗涤和两次乙醇洗涤来减少终产物中的污染物。作者的结论是逆转录和RT-qPCR后的阈值更低,以及低丰度转录本的检测灵敏度更高。

固相提取是基于核酸和硅胶柱之间的可逆交联,或磁珠对目标核酸的吸附。在这两种情况下,提取过程都是在有利于结合的缓冲液中让核酸与固相结合,然后洗掉污染物,再将分离出的核酸洗脱。磁珠法的优势在于不使用高速离心,因为这可能打断大分子。

自动提取

核酸提取的自动化主要是用机器人系统来取代手动处理,如缓冲液的交换、样品管的移动和微孔板的堆叠等。自动化的优势在于操作过程保持一致,并且研究人员有时间去从事其他工作。核酸提取的自动化系统也分为两类:多用途的自动化平台和专门的核酸提取系统。

许多多功能平台的制造商已经开发出控制软件,能够自动化完成核酸提取试剂盒操作指南中的各个步骤。同时,这些灵活的系统还能够将核酸提取操作与下游应用相整合。例如,Hudson Robotics的SOLO系统通过OD读板器支持DNA的归一化。它能够与热循环仪整合,完成PCR操作。此外,它还能将整个NGS文库制备流程自动化。

专门的核酸提取设备则占用较少的空间,专为几种试剂盒而优化。制造商不断开发出新的试剂盒和操作,以扩展这些系统的功能。最近,Promega推出了Stabilized Saliva DNA试剂盒,可用于其Maxwell RSC系统。QIAGEN也推出了与QIAcube系统兼容的DNeasy PowerSoil Pro Kit。

特殊用途

通常,细胞采集和裂解之后会立即进行上述的纯化操作,以尽量避免因降解而造成的核酸产量或质量下降。然而,FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)样品和血液采集卡却是两个例外。

全世界的FFPE组织样本库代表了生物医学研究的宝贵资源。不过,为保留样本细节而设计的福尔马林固定过程却对核酸有害,而样品脱蜡又让核酸提取过程进一步复杂化。近年来,各大厂商分别开发出产品,旨在从FFPE样本中高效提取出核酸。

不久前,挪威的研究人员对市场上七种FFPE核酸提取试剂盒进行了比较,并在《Plos ONE》杂志上发表了结果2。他们认为,尽管大多数的试剂盒都是基于离心柱方法,但脱蜡方法、捕获表面和缓冲液组分存在明显差异。他们还提供了有用的信息,可帮助研究人员选择适合特定样本和下游应用的最佳方案。

血液采集卡采用普通滤纸经特殊处理加工而成,用于生物分子的保存。保留在采集卡上的血斑具有很好的稳定性,可以长时间储存,或在室温环境下运输,直至提取过程开始。

尽管血液采集卡已出现多年,但全球健康问题再次推动了产品研发。GenTegra公司的James Nelson博士认为,主要的推动因素是HIV和艾滋病。这家公司主要生产核酸等生物制品的室温存储产品。

人们往往采用定期的HIV RNA检测来确定病毒数量,并监控艾滋病的进展。这些数据可用来评估治疗方法是否成功。“每年有180万新的艾滋病病例,而70%的患者生活在非洲,在那里冷链运输是无法想象的,”Nelson博士解释说。

“在今年的研究中,我们发现我们的血液采集卡能够从干血斑中释放95%的核酸材料。传统的滤纸型卡片丢失了一半左右。这种提取产量的差异提高了HIV监控的效率,将对根除病毒产生重要的影响,”他说。

全新方法

Purigen Biosystems正在开发一种全新的方法。它利用等速电泳(ITP)的原理来分离细胞裂解液中的DNA,并将纯化后的DNA浓缩成小体积。

与凝胶电泳技术不同,等速电泳是基于离子迁移率来分离和聚焦带电分子,而非大小。在电场中,含有高迁移率离子的领先电解质快速迁移,并与含有低迁移率离子的尾随电解质分离。在加入细胞裂解液后,它的DNA迁移速度介于两者之间。经过一段时间电泳后,达到完全分离。

“等速电泳是一种从细胞中提取和回收DNA的新方法,”Purigen Biosystems的Barney Saunders博士称。“传统方法存在产量和纯度变化、流程复杂、盐和溶剂残留等问题。在等速电泳中,盐浓度低得多,并且不需要溶剂或变性剂。没有结合、洗涤或离心。”这家公司正计划通过早期试用项目来检验这项技术。

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