欢迎来到上海远慕生物科技有限公司官方网站!
13310162040

PCR专题:聚合酶链式反应(PCR)

2016-08-22 1:22 来源:上海远慕生物试剂

PCR技术可用于:(1)检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态;(2)有效检测癌基因的突变,准确检测癌基因的表达量
PCR技术

实验方法原理
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;

 
②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
 
③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
 
重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
实验材料
模板DNA
试剂、试剂盒
dNTP Taq DNA聚合酶 蒸馏水 PCR缓冲液 引物 氯化镁
仪器、耗材
PCR仪 移液枪 PCR板 薄壁管 离心管 离心管盒
实验步骤

一、标准的PCR反应体系
 

10×扩增缓冲液     10 ul
4种dNTP混合物   各200 umol/L
引物            各10~100 pmol
模板DNA      0.1~2 ug
Taq DNA聚合酶    2.5 u
Mg2+       1.5 mmol/L
加双或三蒸水至    100 ul
二、PCR引物设计

PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

1.   引物设计的基本原则

(1)  引物长度:15-30 bp,常用为20 bp左右。

(2) 引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

(3) 引物内部不应出现互补序列。
(4)两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。
(5) 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
(6)引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。

(7) 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。

2.   引物设计软件

Primer Premier5.0 (自动搜索)*、Oligo6 (引物评价)、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 (在线服务)。

三、模板的制备

(1)PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。

(2)模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

(3)标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、氯仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

四、PCR反应条件的控制

1.  PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。 

2.  镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5 mmol/L。
  
3.  底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200 umol/L。
 
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。
  
5.  引物 浓度一般为0.1 ~0.5 umol/L。
 
6.  反应温度

(1)变性温度和时间95℃,30 s。

(2)退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。

(3)延伸温度和时间72℃,1 min/kb(10 kb内)。

(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)
 
7.  循环次数 :一般为25 ~30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增 加,出现了所谓的“平台期”。

五、PCR的循环参数
 
1.  预变性(Initial denaturation)

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2.  循环中的变性步骤

循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。

3.  引物退火(Primer annealing)

退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略

延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

5.  循环数

大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。

6.  最后延伸

在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。

六、PCR步骤
 
1.  DNA变性

(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA。

2.  退火

(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

3.  延伸

(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。

七、PCR检测
 
PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物 两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。
展开
注意事项  
其他 一、  PCR反应的关键环节

1.  模板核酸的制备。

2.  引物的质量与特异性。

3.  酶的质量。

4.  PCR循环条件。

二、 PCR常见问题及对策

 
1.  假阴性,不出现扩增条带
(1)模板原因

①  模板中含有杂蛋白质。

②  模板中含有Taq酶抑制剂。

③  模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白。

④  在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。

⑤  模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
(2)酶失活

①  需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。

②  忘加Taq酶或溴乙锭。
(3)引物

①  引物质量。

②  引物的浓度。

③  两条引物的浓度是否对称。

解决对策:

①  选定一个好的引物合成单 位。

②  引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。

③  引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。

④  引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
(4)Mg2+浓度

①  浓度过高降低PCR扩增的特异性。

②  浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
(5)反应体积的改变

①  通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定;

②  在做小体积如20 ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
(6)物理原因
 
①  变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性。

②  退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

③  扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。
(7)靶序列变异

①  靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合。

②  靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。
 
2.  假阳性,出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
 
(1)引物设计不合适

①  选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。

②  靶序列太短或引物太短。
(2)靶序列或扩增产物的交叉污染

①  整个基因组或大片段的交叉污染。

解决方案:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。

②  空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生。

解决方案:可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.  出现非特异性扩增:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

(1)  引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。

(2) Mg2+离子浓度过高。

(3) 退火温度过低。
(4) PCR循环次数 过多有关。

(5) 酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有:必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。
4.  出现片状拖带或涂抹带
 
(1)原因

①  酶量过多。

②  酶的质量差。

③  dNTP浓度过高。
 
④  Mg2+浓度过高。

⑤  退火温度过低。

⑥  循环次数过多引起。

(2)对策

① 减少酶量。

②  调换另一来源的酶。

③  减少dNTP的浓度。

④  适当降低Mg2+浓度。

⑤  增加模板量。

⑥  减少循环次数。
收缩
QQ咨询
  • 标准品
电话咨询
  • 客服一  13310162040
  • 客服二  18001933641
邮箱咨询
  • shyuanmusw@163.com