人纤溶抑制因子/凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)ELISA试剂盒说明书

人纤溶抑制因子/凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)ELISA试剂盒
本试剂仅供研究使用

试验原理：
本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中人纤溶因子/凝血酶的纤溶物(TAFI)水平。用纯化的抗原包被微孔板,制成固相抗原,往包被的微孔中依次加入人纤溶因子/凝血酶的纤溶物(TAFI),再与 HRP 标记的抗原结合,形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,经过洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人纤溶因子/凝血酶的纤溶物(TAFI)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计算样品中人纤溶因子/凝血酶的纤溶物(TAFI)浓度。

试剂盒内容及其配制
试剂盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制
96/48份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型
塑料膜板盖1块半块即用型
标准品：400ng/ml 1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀稀
空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型
标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型
生物素标记(TAFI)1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型
亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型
洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀释
底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型
底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型
终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

自备材料
1．蒸馏水。
2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．振荡器及磁力搅拌器等。

安全性
1．避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

样品收集、处理及保存方法
1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2、血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备
1．标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
400ng/ml（6号标准品）原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
200ng/ml（5号标准品）100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
100ng/ml（4号标准品）100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
50ng/ml（3号标准品）100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
25ng/ml（2号标准品）100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
12.5ng/ml（1号标准品）100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0ng/ml（空白对照）原始浓度不用稀释直接加入50ul。
2．洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。

操作步骤
1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5．每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10．如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

人纤溶抑制因子/凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)ELISA试剂盒保存条件及有效期
1．试剂盒保存：2-8℃。
2．有效期：6 个月