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人髓鞘碱性蛋白抗体(MBP)ELISA试剂盒实验步骤

2024-04-08 11:28 来源:上海远慕生物试剂
人髓鞘碱性蛋白(MBP)ELISA试剂盒(用于血清、血浆、细胞培养上清液和生物体液内)

实验原理
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人MBP单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的MBP与单抗结合,加入生物素化的抗人MBP,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液硫酸,在450nm处测OD值,MBP浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中MBP浓度。

试剂盒组成(2-8℃保存)
酶标板(CoatedWells)    96孔    酶标抗体工作液(EnzymeConjugate)    12ml
10×标本稀释液(SampleBuffer)    12ml    20×浓缩洗涤液(WashBuffer)    50ml
标准品(Standards):200ng/瓶    2瓶    底物工作液(TMBSolution)    12ml
第一抗体工作液(BiotinylatedAntibody)    12ml    终止液(StopSolution)    12ml

准备试剂与收集血样
1.收集标本:血清、血浆(EDTA、肝素抗凝)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测,2-8℃保存48小时;更长时间须冷冻(-20℃或-70℃)保存,避免反复冻融。血清、血浆作1:2稀释(取100ul,加标本稀释液100ul,稀释2倍)。细胞培养上清可以不做稀释直接检测。
2.标准品液配制:使用前加入1ml蒸馏水混匀,配成200ng/ml的溶液。设标准管8管,第一管加标本稀释液900ul,第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入200ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul,移至第二管。如此反复作对倍稀释,从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。
3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例:1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。
4.洗涤液:用重蒸水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)

检测程序
1.加样:每孔各加入标准品或待测样品100ul,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2.洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
3.每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。
4.洗板:同前。
5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。
6.洗板:同前。
7.每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗处反应15分钟。
8.每孔加入100ul终止液混匀。
9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断
1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.以标准品20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0ng/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。
3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应MBP含量,再乘上稀释倍数即可。

试剂盒性能
1.灵敏度:最小的MBP检测浓度小于0.16ng/ml。
2.特异性:可同时检测重组或天然的人MBP。不与人其它细胞因子有交叉反应。
3.重复性:板内、板见变异系数均小于9.6%。

注意事项
1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔,每次测定应同时做标准曲线。
2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。
3.板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。
4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。
5.本试剂盒仅用于科研,不能用于临床诊断!

 
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